第二届质谱论坛：质谱在生物医药中的应用
赛默飞世尔科技色谱质谱部应用工程师 刘婷
来自赛默飞世尔科技的应用工程师刘婷 为大家作了题为《高分辨质谱提高代谢物鉴定的数量和可靠性》的报告。
代谢物鉴定的重要性
刘工程师讲到，DMPK贯穿新药研发的始终，FDA以及SFDA里面都有药物DMPK的相关指导原则，即：新药研发中，为了评价药物的安全性和有效性，需要阐明药物的代谢过程，并考察可能的药物相互作用。
2002年MIST法案和2008年的FDA指南都规定了必须要鉴定出主要的代谢产物、活性代谢产物和具有毒性的代谢产物。并且FDA指南规定，在人血液里，在稳态条件下，血液中的代谢产物达到了母药暴露水平的10%则必须进行定量研究。
高分辨质谱提高代谢物鉴定的数量和可靠性
从代谢物鉴定方法的发展来看，1989年以前主要是利用TLC和HPLC 来进行鉴定，耗时长，效率不高，鉴定几种代谢物通常需花费几周甚至几个月的时间，且缺乏定性能力；90年代后，LC/MS技术得到应用，主要应用离子阱质谱和三重四极杆质谱，可以较好地定性，将几个代谢产物鉴定的时间缩短为几周，但是仍无法满足药物代谢研究中高通量的要求；2008年之后，高分辨质谱在药物代谢研究中的应用越来越广泛，这类质谱包括Q-TOF、Orbitrap等，在几天的时间内就能鉴定出1-3个化合物。
那么为什么要用高分辨质谱，多少分辨率才够用呢？药物代谢研究针对的不是标准品而是复杂的生物基质，存在大量的干扰，高分辨的意义就在于可以有效地排除干扰。在举例Isazophos（m/z 314.04941）的药物定量实验中，存在本底噪音（m/z 314.07141），分辨率只有在50,000以上，才可能很好地排除干扰并准确定量。另一个例子是测定红茶中的茶多酚，分辨率达到80,000时才足以准确地鉴定花青素（m/z 577.13405）并排除干扰（m/z 577.15518），和进行定量。
关于精确质量数的作用，可以发表在Clinbiochem. 2010. 08.018上的文献来说明，该例中，质量偏差如控制在±5ppm以内，则能消除假阳性，提高灵敏度。稳定的高质量精度可获得优异的定量RSD重复性，并可准确定性元素组成。而要获得提取色谱峰非常对称的峰形，和稳定的高质量精度，常常需要高分辨（比如举例中需要50,000以上的分辨率）。
代谢物研究中对高分辨质谱的要求是：具备高分辨率和高质量精度，从而保证复杂样品测定的质量精度；同时还需质量精度稳定性好，才能保证每个扫描点的质量精度。赛默飞世尔科技公司的Orbitrap质谱是当今分辨最高的高通量质量分析器，它包括台式Orbitrap系列（Exactive）和LTQ Orbitrap系列。今年ASMS推出的Q-Exactive，分辨率达到了140,000，采集速度提高了两倍；而新推出的LTQ Orbitrap Elite，分辨率达到了240,000，采集速度提高了4倍。
高分辨质谱在代谢产物鉴定的应用思路
高分辨质谱用于代谢产物鉴定，最主要的两条应用思路是应用多种数据采集和数据处理方式。数据采集有多种模式，包括DDPT数据依赖性扫描，可自动激发做多级扫描；母药分子式如含有卤族元素可用同位素激发模式做数据依赖性扫描；依赖仪器需要运用极性切换的功能来进行代谢物确认。
数据分析时用到两类数据：一类是全扫描数据，一类是多级扫描数据。针对全扫描数据分析，常用方法包括质量亏损过滤（MDF）及多重质量亏损过滤（MMDF）、背景扣除、同位素过滤、提取离子流图。针对多级扫描数据分析，常用子离子过滤和中性丢失过滤（即根据一些中性丢失碎片进行代谢物查找）。
应用实例——雷公藤甲素代谢物鉴定
接下来刘工重点列举了雷公藤甲素（Triptolide）代谢物鉴定的应用实例。雷公藤是临床上治疗风湿性关节炎的主要用药，毒性很强，临床表现为肝肾毒性。其中雷公藤甲素是雷公藤的主要药理成分，研究雷公藤甲素的代谢产物特别是反应性代谢产物对解释雷公藤的肝肾毒性有重要的意义。其研究难点在于：质谱离子化效果不佳，响应强度不高。
该实验主要运用赛默飞世尔科技Acclea U-HPLC和LTQ Orbitrap与Q-Exactive质谱进行分析，分别进行了雷公藤甲素体外和体内代谢分析。
在建立LC-MSn方法中，首先对流动相进行了优化，加入了NH4AC帮助形成[M+NH4]+从而提高信号响应，解决了灵敏度问题。LTQ Orbitrap和Q-Exactive质谱主要采用了数据依赖性扫描，其中LTQ Orbitrap主要采用的是CID加宽带激发碰撞模式，Q-Exactive则采用HCD高能碰撞模式，从而得到更多离子碎片信息。
Metworks软件确认代谢物过程实现了数据采集和数据分析两种功能。Metworks软件的MMDF（多重质量亏损过滤）功能用于分析体内大鼠尿液样品，中性丢失过滤功能进行反应性代谢物查找，子离子过滤功能查找代谢物，Mass Frontier软件对雷公藤甲素碎片分析，最终发现了107种代谢物。
中国科学院生物物理研究所 杨福全研究员
来自中国科学院生物物理研究所的杨福全研究员的演讲题为《蛋白质组学技术在生物医学研究中的应用》。
杨老师首先总结了用于蛋白质组学的定性和定量技术。在蛋白质定性方面的主流技术包括两条路线：基于双向电泳和生物质谱的技术路线；基于多维液相色谱-质谱联用技术路线（美国John Yates教授创建）。蛋白质组的定量当前更受到关注，目前也有几种技术：（1）基于表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）的差异蛋白筛选技术，应用于临床生物标志物发现，发现的蛋白分子量小于20,000。（2）基于双向电泳（2-DE）的差异蛋白质筛选技术，可发现10,000分子量以上的差异蛋白，后来还发展出灵敏度重现性更好的荧光差异电泳（DIGE）方法。（3）目前主流的基于LC-MS/MS的定量蛋白质组学，包括相对定量的稳定同位素标记和无标记定量策略，以及绝对定量的基于多反应监测（MRM）的定量策略。标记策略又分为体外标记（如H218O、ICAT、cICAT、iTRAQ），以及体内标记（如SILAC）。无标记定量可以用比较色谱峰面积、收集所有需进行比较的多肽的谱图进行统计分析来相对定量，但为获得更好的重现性，对色谱分离条件和样品都要求较高。在蛋白质组验证阶段，用Western Blot法定量通量太低，所以现在流行用三重四极杆的MRM进行绝对定量。
蛋白质组学在生物医学研究中的应用包括：蛋白质表达谱分析，疾病相关蛋白质生物标志物的发现和鉴定，蛋白质翻译后修饰，蛋白质复合物的鉴定、蛋白质-蛋白质相互作用研究，细胞分化、胚胎发育过程中蛋白质表达变化分析分析，蛋白质功能研究（降解机制、构象等）。其中蛋白质表达谱分析用于血浆蛋白质组学、肝脏蛋白质组学、脑蛋白质组学、尿蛋白质组学、脑脊液蛋白质质组学以及亚细胞器蛋白质组学等。
接下来杨老师列举了自己开展过的多个生物医学相关的研究实例，并总结了一些经验和教训，让每个人都受益匪浅。
基质细胞衍生因子（SDF-1）在血清中降解机制研究中，杨老师用LC-MS的方法和分析化学的经验成功解决了生物学家碰到的问题，该工作发表在2004和2005年的《Blood》上。该工作的研究目的是：生物体内同时存在SDF-1 α 和SDF-1 β的意义何在？SDF-1不断在基质细胞、树枝状细胞、内皮细胞以及其它细胞中表达，在骨髓中不断被降解，其作用的酶是什么？合作的生物学家用新鲜的人血清对重组的SDF-1 α 和SDF-1 β进行20小时的孵育处理后，用SDS PAGE分析，发现了分子量变化，希望杨老师能测定和解释这种变化。但实际上当时生物学家关心的是丢失的那段质量，所以在处理中加了分子量透析步骤，因此开始很难找到质谱信号。在杨老师仔细了解后，建议用LC-MS测定处理后剩余的那段分子量（m/z 7,000~9,000），果然得到了很好的结果。随后对SDF-1 α 的变化进行了动力学的分析和表征。最后的结果表明：在用新鲜血清处理后，SDF-1 α在C端丢失了K、在N端丢失了KP，而SDF-1 β只在N端丢失KP。动力学分析表明SDF-1 α先在C端丢失K、然后在N端丢失了KP，显然有两种起作用的酶。最后鉴定出CD26导致了N端KP丢失，Carboxypeptidase N导致了C端断裂。
和国内某医院合作，杨老师课题组对白血病相关的生物标志物进行分离鉴定。医院首先对健康人和白血病患者的血清进行了SELDI分析比较，找到潜在的标志物（目标蛋白质）。随后，杨老师建立了一套综合的方法来分离鉴定目标蛋白质。前处理包括对血清样品脱盐、去除高丰度蛋白、HPLC分离然后得到纯化的目标蛋白，然后综合运用MALDI-TOF-MS直接测定分子量、酶解后用LC-MS/MS测定肽段及蛋白质、N端序列测定等方法，最后成功地鉴定了目标蛋白质。
另一项和医院的合作是肿瘤死亡预警蛋白质的分离鉴定。初步的临床观察显示：对比不同肿瘤患者血清的SELDI-TOF-MS检测谱图，可发现一组与肿瘤患者病情加重和预后密切相关的异常血清蛋白特征峰，其分子量范围为11.1-11.9kDa，暂命名为死亡预警蛋白，简称LGT。中晚期患者血清中LGT与预后的关系：LGT持续（+）2-3个月，死亡率90%以上，LGT持续（-）为零死亡；LGT由（+）转（-），死亡率10%。LGT疑似（±）死亡率10%。杨老师课题组将这组LGT蛋白进行MALDI-TOF-MS分析，得到了13种蛋白的鉴定结果。
其它的研究还包括：线虫线粒体蛋白质表达谱分析；大鼠L6肌管细胞磷酸化蛋白质组分析；胰岛β细胞线粒体的蛋白质组及其磷酸化信号网络的构建；SILAC定量蛋白质组学技术应用于L6骨骼肌细胞分化前后蛋白质表达差异分析等等。由于时间有限，没有更多地展开介绍。但接下来，杨老师回答了现场很多听众的热烈提问。
