质粒DNA的电泳检测
实验概要
通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。
实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA，简称 CCCDNA)；开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂，（open circular DNA， 简称OCDNA）；线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂，（linear DNA，简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA和开环质粒DNA。
主要试剂
1. 10 x TAE (10倍体积的TAE储存液)
配 1000mL50 x TAE：
Tris 242g
冰乙酸 57.1ml
0.5 mol/L EDTA 100 ml
pH 8.0
2. 凝胶加样缓冲液（6x）
溴酚蓝 0.25％
蔗糖 40％
3. 琼脂糖（1%）：称1g琼脂糖，放入250 mL三角瓶内，加入100 mL 1×TAE电泳缓冲液，加热煮沸等其冷至60℃左右，倒入封好的电泳板上。
4. 溴化乙锭溶液 (EB) 0.5 μg /mL。
主要设备
电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、移液枪一套、微波炉。
实验步骤
（一）制备琼脂糖凝胶
按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：
琼脂糖凝胶浓度／％ 线状DNA的有效分离范围／Kb
0.3 5 ～60
0.6 1 ～20
0.7 0.8～10
0.9 0.5～7
1.2 0.4 ～6
1.5 0.2～4
2.0 0.1～3
称取0.1g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入10mL 1XTAE缓冲液，至微波炉加热至完全溶化，取出摇匀，则为1％的琼脂糖凝胶液。
（二）胶板的制备
1. 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好。
2. 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。
3. 将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。
4. 待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。
5. 加入电泳缓冲液至电泳槽中。
（三）加样
将样品5uL与上样缓冲液1uL混合，用移液枪将该混合样品加入样品孔（记录点样顺序及点样量）。同时加入DNA marker和购买的pUC18质粒
作为对照。
（四）电泳
1. 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5 V/cm。
2. 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1～50px处，停止电泳。
（五）染色
将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液（0.5mg/mL）中，染色以观察在琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作）。
（六）观察
注意事项
1．EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清 洗或丢弃。
2．当EB太多，胶染色过深,DNA带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，30分钟后再观察。
3．电泳时注意导线正负极，防止接反。
