质粒DNA的超速离心分离（一）
一、简述
近代质粒DNA分离纯化以从大肠杆菌中分离为代表，鉴于大局杆菌（E.coli）在分子生物学研究中的重要地位，从E.coli中分离纯化质控DNA〈Piasmid DNA〉成为近年来超离心技术中一个重要课题。而质粒DNA的快速分离纯化又对超离心设备（超速离心机、转头和附属设备）提出了更高要求。
E.coli是典型的原核细胞生物，由于原核细胞缺乏其核细胞所具有的那种由单位膜组成的可把多种功能组分分隔为专一化的和局部独立区域的内膜系统，因而没有其核细胞所包含的细胞器（核、内质网、高尔基体、线拉体、溶酶体等等）。电镜显微照片显示E.coli有两个可以区别的内部区域一一细胞质和核质，在它们外面围着一层较薄的细胞质膜和很厚的细胞壁，在细胞壁外部附着一些一端游离的鞭毛。质粒DNA位于核区，以细丝状存在，这种细丝状物在多种情况下是极长的环状DNA的一些片断所折叠起来的聚密体。
针对E.coli的显微结构待点，在进行超离心分离纯化质粒DNA之前的预处理顺序是：
E.coli→用溶菌酶去细胞壁→用表面活性剂如SDS、Triton X-100等破细胞膜→用乙酸钠使DNA、RNA及蛋白质大部分沉淀(90%以上)。
沉淀物可以在加入TE缓冲液(10m-MTris-HCL lmMEDTA,pH8.0)后分子筛上柱去蛋白,去RNA;也可以用超速离心法去蛋白质,去RNA，去级状DNA或DNA断片。本文将综述后一种方法在近年来的新进展.
二、质粒DNA超速离心分离的最新进展
1、
传统的分离方法：数年前，由于受设备条件限制，质粒DNA的分离一般用CsCl平衡等密度离心法，自形成梯度。以10~12ml单管容量为例，用甩平转头分离，36.000rpm×60小时，用角式转头分离45,OOOrpm×36小时，前者包括加减速在内共用去1.3亿转驱动部寿命，后者也要用去1亿转驱动部寿命，这对当时超速离心机总寿命为100~200亿转来看，无疑每次实验费用过高，加上CsCl用量多、价格贵等因素，使这类分离纯化工作成为非常昂贵的实验。
2、新进展：
（1）超速垂直管转头的离心分离（钦合金或碳纤维制造的）：从1975年垂直管转头向世后，近年来各主要离心机生产商开发的垂直管转头，单管容量0.2ml到4Oml，最高转速从50,000rpm到120,000rpm,RCFmax可达
700,000×g，90年代开发的新机型和转头己能够使质粒DNA垂直管离心分离实验做起来得心应手。
使用垂直管转头分离纯化质粒DNA的待点是：.
·由于沉降距离最短，离心时间最短，高效、低耗：
·离心管纵向剖面积远大子横向截面积，离心沉降时纯祥品区带的容量较大，在没有沉淀附着或沉淀附着很紧很密的条件下分离纯度高，样品加载量也较大；流体静压力,不会因静压过高而使生物体颗粒受到损伤.离心管内样品颗粒受到的流体静压为：
式中：ω：角速度
r：样品颗粒所在位置与旋转中心距离（以厘米计）
r1:转头最小离心半径即rmin（厘米），在使用gmax离心时是液面和旋转中心的距离。
Pa:起始密度（对预形成梯度时为最小密度,对自形成梯度离心,为离心结束时最小密度）。
a：梯度斜率
在超速离心中，P值相当大，一般认为P≤1500kg/cm2,才不致损伤生物体颗粒，垂直管转头（r-r1）很小,相对说P也相当小（102数量级），而对甩平转头，在离心前往往要进行P值校核，过大时，应降低转速。在用垂直管进行质粒DNA分离纯化时，RNA沉淀附在离心管壁部，在减速、梯度方向转换时,质粒DNA区带从沉淀区"擦"过，使DNA中混入少量RNA而影响纯度。
在极高转速离心时（如大于80,000rpm），由于RNA附着壁部较紧,这种影响较小。
(2)近垂直管转头离心分离：为了消除垂直管转头用于质粒DNA离心在壁部形成的RNA沉淀对已形成的DNA区带的污染，同时也为了改进一般斜角式转头（倾角25·~35·）由于沉降距离较长，因而分离时间也较长的缺点，近几年开发了多种近垂直管转头（即Near
VerticalTube Rot时,简称NVT转头或Neo Angle
Rotor,小假角转头,简称NT).它们的离心管纵剖面中心轴线与离心机驱动轴线之间夹角在7.5·~10·之间,转速从65,000rpm到120,000rpm，RCFmax可达646,000×g单管容量从2ml至13.5ml。NVT（或NT）转头的开发主要是为质粒DNA分离而设计，当然它也适用于线粒体DNA、染色体DNA、RNA及血清脂蛋白的分离·纯化。
使用NVT（NT）转头分离纯化质粒DNA的特点是:
离心所需时间比垂直管转头稍长（增加30%~40%），但比一般斜角式转头短（为同类斜角式转头分离时间的60%~70%）。
虽然因为倾角小而使RNA版离心管外壁下滑分力较小，但在加入表面活性剂(如0.1%~0.001%Triton X-100）后，RNA沉淀可以较快地滑向离心管底部（即在自形成梯度时,RNA已到达底部），在梯度转换过程中不影响质粒DNA纯度；
流体静压小，极高速运转时也不会损伤生物体颗粒；
离心管纵剖面比一般角式及甩平转头部大，分离纯度高，样品加入量较大。
（3）不连续阶梯梯度分离:质粒DNA分离纯化传统方法是采用全管CsCl自形成梯度平衡等密度离心法，离心开始时全管CsCl密度均一，样品均匀分布其中。
CsCl自形成梯度的离心时间可以用下式计算：
式中N：实际转速(rpm)
P:样品（如质粒DNA）在CsCl的浮动密度
r:从旋转中心到纯样品带中心的距离（厘米），作为初步结算，对质粒DNA离心，r位置可定在离心管中部，r平均刊点再偏外-10%。（rmax-rmin）。
F:取决于梯度材料及溶液初始密度的常系数〈表1〉。
S20.w：样品（质粒DNA）在20℃水中沉降系数，可参照有关文献决定。
[注]表中TCA为三氯乙酸,TFA为三氟乙酸
