新型冠状病毒Mpro/3CLpro抑制剂筛选试剂盒(增强型)使用...
新型冠状病毒Mpro/3CLpro抑制剂筛选试剂盒(增强型)使用说明
1.样品的准备。
取适量待测定的抑制剂样品，用Assay Buffer或DMSO等适当的溶剂配制成适宜浓度的溶液，如果有必要可配制成适当的浓度梯度待用。
2.阳性对照的准备。
本试剂盒提供的阳性对照抑制剂Ebselen浓度为10mM，配制在DMSO中，可以根据需要使用与待测抑制剂一样的溶剂稀释成所需浓度或浓度梯度。通常Ebselen的IC50约为0.5μM-2μM，使用本试剂盒时Ebselen的抑制效果参考图2。
3.样品测定。
a.根据样品数量(含相关对照)，参考下表配制适量的Assay Reagent。注：由于2019-nCoV Mpro/3CLpro的甘油含量较高，微量吸取时要注意避免吸头吸附损失并吹打完全，加入2019-nCoV Mpro/3CLpro后需要注意充分混匀。
| 1个样品 | 5个样品 | 10个样品 | 20个样品 | |
| Assay Buffer | 92μl | 460μl | 920μl | 1.84ml |
| 2019-nCoV Mpro/3CLpro | 1μl | 5μl | 10μl | 20μl |
a.参考下表，使用96孔黑板设置各组别，并按照下表依次加入检测试剂和样品。加入待测样品后，混匀。为获得更加可靠的检测结果，建议每个样品至少应该进行2个重复孔的检测。
| 空白对照 | 100%酶活性对照 | 阳性抑制剂对照 | 样品 | |
| Assay Buffer | 93μl | - | - | - |
| Assay Reagent | - | 93μl | 93μl | 93μl |
| Ebselen溶液 | - | - | 5μl | - |
| 样品溶剂 | 5μl | 5μl | - | - |
| 待测样品 | - | - | - | 5μl |
注：样品溶剂是指配制和稀释待测抑制剂所用的溶剂。
b.各孔快速加入Substrate 2μl，混匀。注：加入Substrate后反应会立即开始，如果孔数较多的情况下，建议在低温或使用排枪操作以减小各孔间加入Substrate的时间差而导致的误差，混匀操作可在培养板振荡器上进行。
c.37℃避光孵育5分钟后信号即趋于稳定，可在5-20分钟内使用多功能酶标进行荧光测定。激发波长为340nm，发射波长为490nm。当荧光读数偏低时，也可适当延长孵育时间至20-30分钟。
注：也可在步骤a中将待测样品加入后37℃孵育10分钟，再将Substrate加入反应体系中。37℃孵育10分钟再加入Substrate可能会降低抑制剂的IC50。建议通过预实验确定未知抑制剂比较适合的孵育时间。
4.计算:
a.计算每个样品孔和空白对照孔的平均荧光值，可分别记录为RFU空白对照、RFU100%酶活性对照、RFU阳性对照和RFU样品。RFU，Relative Fluorescence Unit。
b.计算每个样品的抑制百分率。计算公式如下：
抑制率(%) = (RFU100%酶活性对照 - RFU样品) / (RFU100%酶活性对照 - RFU空白对照) × 100%
c.对于检测发现有效的抑制剂，通过检测该抑制剂的剂量效应就可以计算出该抑制剂的IC50。使用本试剂盒检测Ebselen对于2019-nCoV Mpro/3CLpro的抑制作用的检测结果参考图2，Substrate直接加入反应体系中，然后孵育5分钟进行荧光测定，IC50约为0.62μM。
图2. 新型冠状病毒(2019-nCoV) Mpro/3CLpro抑制剂筛选试剂盒(增强型)检测Ebselen的效果图。实际检测结果可能会因样品和检测条件等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
