凝胶迁移实验（gel shift）基本知识问题与回答-2
1.AP1（激活蛋白1）：
是一个转录调节因子，它结合的同源序列为5'-TGAGTCA-3'。当基因的启动子区域存在AP1的结合位点时，这些基因可以被诱导，比如用佛波酯可诱导蛋白激酶C（2,7）。在细胞中，AP1形成c-Jun或Jun相关蛋白的同聚双体，或者形成c-Jun或Jun相关蛋白和c-Fos或Fos相关抗原（Fras）的异源双体。Fos蛋白自身不能形成同聚双体，并不能单独和AP1结合位点结合。c-Jun蛋白是一个40KD的单体蛋白并通过亮氨酸拉链形成同聚双体。在HeLa细胞中，AP1的主要形式是c-Jun蛋白的同聚双体。在凝胶迁移实验中，形成一个特异的复合物。当作凝胶迁移实验测定
AP1的活力时，除了基本的溶液组分外，应将0.01mg/ml poly dI:dC，100μg BSA，5mM
DTT加入到结合缓冲液中。如用纯化的蛋白，则用1-2μg的蛋白来检测迁移复合物。
2.AP2:
是一个转录调节因子，可分别作为TPA-和cAMP诱导因子。它是一个52KD的蛋白，识别的同源序列为5'-CCCCAGGC-3'或5'-
GCCNNGGC-3'。这个因子对视黄酸特别敏感，可能在形态发生中起着重要作用。HeLa细胞核抽提物和AP2同源DNA探针形成一个特定的复合物。用纯化的蛋白作凝胶迁移实验时，应用20-50ng的蛋白。
3.CREB:
是一个37KD的转录调节因子，对cAMP应答，识别5'-T（G/T）ACGTCA-3'DNA同源序列。它含亮氨酸拉链结构而形成同聚双体，相关的基本结构域和c-JunDNA结合结构域同源。当用HeLa细胞核抽提物时，能和CREB同源序列形成一个复合物。
4.NF-kB:
最初被鉴定为在B细胞中和免疫球蛋白k轻链的增强子结合。但随后在非B-细胞的细胞质中被发现，形成NF-kB和IkB的复合物。最初在DNA结合蛋白复合物中分离的NF-kB是由p65（RelA）和p50构成的异源双聚体。其他分离的单体包括p49（也可称为p52），p75（c-
Rel），p68（RelB）。p65，p68，p75单体起反式激活作用。p50，p49（p52）单体具有DNA结合活力，但只具有微量的反式激活作用。据报道p49和NF-kB的单体p65形成具有转录活力的异源双体，类似于p50/
p65异源双体。p49/ p65和p50/
p65异源双体在细胞质中受一种叫IkBa/MAD-3的抑制剂调节。IkB和p65单体结合，阻制了细胞核中的定位和DNA的结合。在体外高浓度的
p65能形成同源双聚体，能和DNA微弱地结合。Poly dI:dC
能抑制这一反应。p49和p50也能形成同源双聚体，但在细胞中的浓度很低。通常，在作NF-kB的凝胶迁移实验时，在20μl的反应体积中，有溶于10mM
HEPES的0.28pmoles的NF-kB9寡核苷酸（pH7.9）， 50mMKCl，0.2mMEDTA， 2.5mM DTT,
10%甘油，
0.05%NP-40。当用纯化的蛋白时，250-300ng足以形成凝胶迁移复合物，而需用10μg的HeLa细胞核抽提物。凝胶迁移复合物在室温中保温30分钟，在50mM
Tris（pH8.3）和38mM甘氨酸的7%聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离凝胶迁移复合物。含考马斯兰和二甲苯蓝色素的加样溶液只能加入到阴性对照反应中，因这两种色素会加剧NF-kB复合物的解离。当用HeLa细胞核抽提物作为结合蛋白来源时，可形成两种序列特异的凝胶迁移复合物，即p50/p50同源双聚体和p50/p65异源双聚体。在表达p49，p50，p65的细胞中，可检测到4个序列特异的凝胶迁移复合物（p49/
p49，p50/ p50，p50/ p65，p49/
p65），如果存在高浓度的p65，可检测到微量的p65/p65。下列试剂可加强NF-kB在体外的结合：mM的GTP，ATP，精胺，亚精胺，钡或钙离子。
5.OCT1:
是OCT转录调节因子家簇中的一员，显然在哺乳细胞中存在比较广泛。POU结构域包括POU-box和Homeo结构域。当用HeLa细胞核抽提物时，可检测到一个与OCT1同源探针形成的序列同源凝胶迁移复合物。
6.SP1:
是一个O-糖基化的转录调节因子，它识别10个核苷酸长度的同源序列5`-GGGGCGGGGC-3`。核心识别序列是5`-GGGGCGGG-
3`。同核心序列相似的序列常存在于启动子中。SV40的早期启动子就是一个例子，它是第一个可以结合SP1的启动子。根据糖基化的不同，它的分子量在
95-105KD，DNA结合结构域中的三个锌指纹决定了序列的特异性。HeLa细胞核抽提物与SP1同源探针形成特异的凝胶迁移复合物。
7.TFIID/TFIIB:
是基本的转录调节因子，参与RNA聚合酶II启动子的基本的转录。TFIID与真核启动子的TATA区域形成特异的DNA结合。TFIID由几个蛋白组成，而其中的TATA区域结合蛋白（TBP），参与TATA序列的结合。TFIID的其他的蛋白组分被称为TBP-相关因子（TAFs）。用
TFIID探针寡核苷酸和HeLa细胞核抽提物，可得到一个微弱的凝胶迁移带，但很难确定为是TFIID序列特异凝胶迁移复合物。纯化的重组的TBP很难作凝胶迁移实验，这部分是由于TBP存在很强的正电荷，导致TBP/DNA复合物很难进入凝胶。纯化的TBP形成二聚体后不能结合DNA。因此形成的二聚体可参与DNA结合。TFIIB不单独与DNA结合，但与TFIID结合后增强它与DNA的结合。
