PCR实验的质量控制方法和措施
必须对DNA和RNA分析的各步进行质量控制,以避免假阳性和假阴性,保证测定结果的准确性和重复性。由于核酸扩增测定的高敏感性,所以标本制备、逆转录、扩增本身和产物分析中的每一步都要求有质控措施。
(1)标本制备: 常用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA提取效果,以判断所提取的DNA是否发生降解。用常规的手工提取方法制备的DNA的平均长度一般为~100kb,用适合PCR的DNA提取试剂盒制备的DNA的长度平均范围为30-40kb。明显出现降解的DNA(在1和10kb的低分子量范围内)在经琼脂糖凝胶电泳分离和用溴化乙锭染色后也可见强的荧光信号。用对甲基化不敏感的限制性内切酶(如EcoRI)消化DNA,然后电泳分离,能够对酶活性的抑制剂进行质控(在抑制剂存在的情况下,高分子量的片段不被酶切)。潜在的抑制剂的存在通常用260nm和280nm的分光光度测定来估计,质量好的DNA提取物,A260/A280比值应该在1.75~2.0之间；否则,残留的蛋白或酚可能会很高。仅用光度计比色方法不能对DNA的完整性下结论。
最快的对总RNA提取质量控制的方法是在非变性条件下作琼脂糖凝胶电泳,这一点跟DNA分离相同。但如果对结果有疑问,就应该在变性的条件下作琼脂糖凝胶电泳以检测RNA的完整性。在理想情况下,三种主要的核糖体RNA(28S、18S和5S)在凝胶上出现的带相对较窄。如发生RNA的降解,则出现大量低分子量带或出现带的消失。测定核糖体RNA带的密度指数可作为对RNA制备的质量评价的实验室内的标准；对向低分子量拖尾的、不对称性的峰的评估也是RNA完整性的合适的指标。另外,琼脂糖凝胶电泳能显示出在RNA的制备中被DNA污染的程度。由于这些原因,单独的光度计比色方法也不能对RNA的完整性下结论。
对于血清(浆)中病毒的测定,则要评价标本出现溶血、脂血和黄胆情况下标本处理方法对扩增检测的影响,避免由于标本处理方法的不当而出现假阴性结果。此外,还可采用已知浓度标本评价核酸提取方法的效果。
(2)逆转录和扩增:本部份包括阳性质控和阴性质控。
对逆转录和核酸扩增的质控既可使用内标质控方法也可采用外标质控方法。逆转录-扩增检测的内标通常为在整个细胞周期中均匀表达的mRNA,如HLA、β肌动蛋白和组蛋白H3.3的mRNA或14S rRNA等。此外,也可在标本制备时将外来内标加入到样本中共同提取、逆转录及扩增。当标本中存在逆转录抑制物,或核酸提取中发生RNA降解,或逆转录酶失活,内标即会表现为阴性结果。
对于DNA测定内标可使用对有机体存活所必须的靶基因,如维生素D血浆结合蛋白的基因。对于病原体的基因检测,内标多采用人工制备的竞争性内标。内标可以监控每一扩增孔中假阴性的产生情况。
目前的商品试剂盒大部分没采用内标方法质控。因此在测定血清/血浆病原体核酸如HBV DNA、HCV RNA等时,应使用已知的弱阳性血清/血浆作为质控样本,与待测临床标本等同处理提取核酸及扩增,以判断逆转录及扩增检测的效果。
使用这些外加弱阳性质控不但可检测扩增反应液的质量,还可获得有关PCR试剂的检测下限和特异性的信息。这些质控样本在扩增检测时必须使用与患者的标本相同的主反应混合液。
每一个PCR实验中都必须设有外加阴性质控(污染监测质控),为判断扩增过程中污染出现的阶段,阴性质控可包括如下几种,即在样品制备的整个过程中所带的空白管、仅有扩增反应液但不含扩增模板的反应管、阴性标本等。阴性标本可以评估PCR实验的综合质量。
在扩增靶RNA的RT-PCR实验中,可做省略逆转录的污染质控,通过这种方法,可发现以前扩增的DNA片段所引起的污染。
(3)板上杂交和膜上斑点印迹杂交的质控:在板上杂交和斑点杂交时,阳性和阴性质控应该在同一板或膜上与病人标本平行进行分析,这可排除不同反应中因使用不同杂交条件所致的对结果的错误解释。
(4)测定结果的评价与报告:采用实时荧光定量PCR检测方法,在判断结果时,应先对扩增的荧光信号作出定性判断,然后再进行定量分析,避免一些非特异荧光信号对结果分析的干扰。
结果的报告必须简单清楚。定性测定报告“阳性”或“阴性”即可。定量测定则必须报告量的多少,如结果高于测定方法线性范围上限,则对样本稀释后再测,结果乘上稀释倍数；如结果低于方法的测定范围下限,则报告<多少即可,不能报告为“0”或“阴性”。
