血清替代品：XerumFree XF205培养基添加物使用说明（四）

2020.6.09

细胞的继代

--吸取细胞培养基，用DPBS(无Ca++/Mg++)洗细胞一次。

--用足够体积的Accutase^TM溶液浸没细胞层并在37℃孵育5min。如必要可通过轻轻地拍打细胞培养器皿的侧面分散细胞。

--加入完全培养基稀释细胞消化溶液（至少加两倍体积的Accutase^TM）

--转移细胞悬浮液到离心管中，然后以300×g离心5min

--弃上清然后在完全培养基中通过轻轻地吸吐重悬细胞

--细胞计数

--以2000个细胞/cm²的密度接种细胞悬浮液到一个新的包被的培养板中或即用型Synthemax^TM培养皿中（参看上面“培养器皿表面的包被”）

--在37℃，5% CO₂的湿润孵育器中孵育细胞

--当细胞融合达到近70%时尽快地进行继代培养，一般情况下每周继代两次。

2.3 原代培养

原代细胞培养物存在于刚刚从活的组织或器官分离而来的生长的细胞。这些细胞代表着细胞培养世界的核心：到目前为止所有的细胞系都起始于原代培养。除了产生新的细胞系，原代培养代表着一个非常重要的工具，尤其在药物发现和生产，再生医学和基础研究领域里。

从技术角度来看，在细胞培养过程中原代细胞培养仍然是最微妙的一部分。新分离的细胞没有任何选择压力且高度保留着体内部分的特征。这就要满足新分离细胞对营养和生理的要求。在理想地情况下，对于原代细胞的培养应尽可能地模仿体内的环境，比如细胞外空间。只在明确的细胞培养条件下，且对营养和细胞因子的供给完全地控制才能够实现这一理想情况。

原代细胞培养有着非常不同的要求，取决于组织的来源。在无不明确的添加物比如牛血清或其衍生物的条件下，已经证明XerumFree^TM在不同的原代细胞培养中取得成功。然而，没有一个通用的能满足所有原代细胞类型培养的配方。

下面的指导方针分为两部分：应用于所有细胞类型的常规建议和主要组织类型的具体要求。

2.3.1 常规建议

无论所用的是哪种细胞类型，如果选择无血清条件下进行原代细胞培养，需按照以下几点进行处理。

无血清贴壁因子

准备步骤--培养器皿表面的包被

在明确的培养条件下，用足够的包被剂处理培养表面是至关重要的。通常细胞外基质（ECM）的制备较粗糙，比如小鼠肉瘤提取物（比如基质胶）或提取的胶原。然而，不明确的天然成分和动物源成分的存在显示许多应用是有问题的。

如果不想培养基中含有的动物源成分造成任何问题，快速的解决方法可以考虑用已采用少量FBS过夜处理的细胞培养板。这个方法是方便经济有效的，然而它将意味着从完全明确的培养环境的概念中后退一步。

今天可以用现成的重组的，明确的包被试剂盒，尽管是来源于纤连蛋白，层粘连蛋白，胶原蛋白，E-钙粘蛋白，玻连蛋白等生物合成的信号肽，但能模仿ECM蛋白的贴壁性质。

无血清酶抑制剂

消化酶

开始一个原代培养主要有两种方法：通过从组织块中分离或酶解离而来的产物。在后一种方法中起始组织用蛋白水解酶或酶溶液消化，比如分散酶，胶原酶和胰蛋白酶。

接种细胞之前必须小心地中和/失活任何有蛋白水解活性的成分。尤其是使用胰酶时必须解决这个问题。

无血清的环境中使用标准胰酶制备可能会出现问题，因为血清中含有胰蛋白酶抑制剂。分散细胞之后，在无血清条件下胰酶活性必须被失活，可以用一个高效的胰酶抑制剂，比如大豆胰酶抑制剂。

作为胰酶的替代品，强烈建议使用Accutase^TM，因为其不需要被失活。这个重组的非哺乳动物来源的酶已经高效地应用于一系列原代细胞培养中，包括原代平滑肌细胞，原代人内皮细胞，原代鸡神经细胞。

无血清蛋白的结合

抗生素的使用

像其它化合物一样抗生素结合到血清的血浆蛋白上，尤其是白蛋白片段。因此，在无血清和白蛋白的条件下同样的抗生素浓度将显示出较高的生物活性，且增加的活性将对细胞生长造成有害影响。尤其是链霉素会干扰哺乳动物细胞蛋白合成水平。

如果无抗生素培养是不可行的，我们建议使用浓度为50mg/L的庆大霉素。

2.3.2. 针对细胞类型的具体建议

根据组织来源不同，原代细胞培养有不同的细胞培养要求。

在这个册子里我们没有具体描述原代细胞培养操作流程，因为不同的细胞类型之间是截然不同的。一般情况下我们建议用传统的方法分离原代细胞，并且用5倍浓缩的XerumFree^TM代替血清。

这将满足大多数细胞类型的营养需求，事实上，在哺乳动物细胞培养这个领域，营养需求稍有不同，更多地依赖于细胞类型，比如肝细胞需要更高的营养浓度。

不同类型的细胞之间对生长因子和激素的需求是不同的。

下面的表格列出了我们推荐用XerumFree^TM代替动物血清的细胞培养基制备。

关于指定的四种细胞类型，生长因子和激素的添加对于细胞发育和增殖是理想的。

2.3.3推荐的四种主要的原代细胞类型的细胞培养基的建立

原代细胞培养类型	推荐	终浓度	要求
生长因子	激素
原代肾细胞
XerumFreeTM XF205 2% 基础培养基： DMEM高葡萄糖/F-12 或肾上皮细胞基础培养基比如ATCC®PCS-400-030		重组人胰岛素	0.5 ug/ml	必需的
	皮质醇	0.1 ug/ml	必需的
	肾上腺素	0.5 ug/ml	必需的
重组人EGF		50 ng/ml	理想的/有益的
	三碘-L-甲腺原氨酸	10 pg/ml	必需的
重组人EGF		10 ng/ml	理想的/有益的
原代肝细胞
XerumFreeTM XF205 2-3% 基础培养基： Williams's Medium E		重组人胰岛素	5 ug/ml	必需的
	皮质醇	0.5 ug/ml	必需的
重组人EGF		50 ng/ml	理想的/有益的
原代角质细胞
XerumFreeTM XF205 2% DMEM/F-12 1:3 ratio		牛垂体提取物（BPE）	4 ul/ml	必需的
	皮质醇	5 ug/ml	必需的
	肾上腺素	0.5 ug/ml	必需的
	重组人EGF		0.125 ng/ml	理想的/有益的
原代心肌细胞
XerumFreeTM XF205 2% Claycomb Medium		T3（三碘-L-甲腺原氨酸）	1ng/ml（1.5nM）	必需的
	重组人胰岛素	5 ug/ml	必需的
重组人EGF		5 ng/ml	理想的/有益的
重组人bEGF		5 ng/ml	理想的/有益的
神经元细胞
XerumFreeTM XF205 2% DMEM高葡萄糖	重组人EGF		50 ng/ml	理想的/有益的
	重组人胰岛素	0.5 ug/ml	必需的