血清替代品：XerumFree XF205培养基添加物使用说明（三）
重点注意事项：
--XerumFreeTM不含任何的生长因子，因此也不含有bFGF和胰岛素。培养干细胞时我们建议添加bFGF或胰岛素或IGF。
--XerumFreeTM不含硒，培养干细胞时我们建议用含有硒的培养基。
2.2.2 hESCs 和hiPSCs的无饲养层培养
按照上面的包被步骤在含有2-3%的XerumFreeTM的DEME/F-12培养基里培养多能干细胞。
外部的和自分泌的信号的作用是基质重塑和维持胚胎干细胞的更新（Przybyla, L.M. and Voldman J. PNAS vol. 109 no. 3, 835-840, 2012）。基于此，为了不耗尽这些重要因子，按照下面的描述改变操作步骤使其粘附在培养基中极其重要。
hESCs和hiPSCs完全培养基的制备
--使用常规基础培养基（比如DMEM-F12）
--添加浓度为2 mM的L-谷氨酰胺到培养基中（比如吸取200 mM的母液1.0ml到终体积为100ml的培养基中）
--添加bFGF使终浓度为4 ng/ml（比如母液为10 ug/ml吸取40ul到终体积为100ml的培养基中）
--添加2-巯基乙醇使终浓度为0.1mM（比如母液为55mM吸取182ul到100ml培养基中）
--如果使用抗生素保护体系，我们建议使用浓度为50mg/ml的庆大霉素。
--因为XerumFreeTM不含胰岛素，你可以添加（重组）胰岛素或IGF到培养基中
--如果必要可以滤灭培养基
--添加2% 的XerumFreeTM XF205
含有XerumFreeTM的培养基中培养hESCs—第一阶段
--用MatrigelTM或StemAdhreTM包被6孔培养板或用SynthemaxTM培养器皿。
--融化一瓶新鲜的hESC或从现有的培养基中转移hESC细胞（从饲养层或无饲养层培养体系），用胶原酶或其它更好的方法处理，像平常一样使用Accutas和sediment，Accutas是非动物源的且具有蛋白酶和胶原酶活性，在hESC细胞的培养中已显示出显著的效果。
--用MatrigelTM或StemAdhreTM包被培养板：吸取过量的Matrigel或StemAdhre包被试剂
--SynthemaxTM培养板：无需处理，即可使用
--置细胞于按照以上步骤制备的完全培养基中
--通过连续7天每天更换75%的培养基培养细胞，余留25%的含有细胞的自分泌因子的培养基是非常重要的。
注意：与MEFs相比，细胞在MatrigelTM包被的板子上生长的更好且密度更高，且不失其形态学特征
细胞培养的传代
--用DPBS洗细胞一次
--添加分散酶（比如在DMEM-F12培养基中每孔添加1ml浓度为2mg/ml的酶溶液）并在37℃中孵育
--通过轻轻地拍打培养板的一侧在10-15 min内分散细胞
注意：勿刮细胞
--把含有细胞的分散后的溶液转移到一个灭菌的15ml管中，为了收集尽可能多的细胞，再用每孔1ml的生长培养基冲洗培养孔。
--离心并洗两次
--用吸头轻轻地吹打细胞，这样可使细胞在分散酶中轻易地分散开。
注意：体积较小的细胞和单个细胞不能很好地存活。
--以正常的比例包被培养板（Matrigel, StemAdhere, Synthemax-请参看上面的说明）
2.2.3 MSCs的培养
下面操作规程是在明确地环境中培养MSCs，可以是从液氮中保存的冰冻的细胞系或在不同的细胞培养体系中生长的培养物。
一般考虑
--如果MSCs细胞没有及时接种应保存在液氮中，过高的温度（-80℃）将对细胞造成不可逆的损伤。
--使用无菌操作技术且在超净工作台里操作
--37℃，5% CO2孵育箱内湿润孵育细胞
--培养器皿必须按照在使用说明B部分的准备步骤关于“培养表面的包被”的说明来处理
--细胞接种密度以2000 /cm2，避免生长的细胞融合，当细胞密度达到大约70%时继代一次
--使用无需经血清失活的消化酶，比如AccutaseTM
--收集之后，轻轻地吸吐细胞使其重悬，不要旋涡细胞
--按照下面的描述准备细胞培养过程中所用到的所有材料和设备
--预热所有与细胞接触的溶液和培养基
完全培养基的制备
--你可以用你常规使用的基础培养基
--添加浓度为2 mM的L-谷氨酰胺到培养基中（比如吸取200 mM的母液1.0ml到终体积为100ml的培养基中）
--添加bFGF使终浓度为4 ng/ml（比如母液为10 pg/ml吸取40pl到终体积为100ml的培养基中）
--如果使用抗生素保护体系，我们建议使用浓度为50mg/L的庆大霉素。
--因为XerumFreeTM不含胰岛素，你可以添加（重组）胰岛素或IGF到培养基中
--如果必要可以滤灭培养基
--添加2% 的XerumFreeTM XF205
解冻细胞
在解冻过程中，必须要小心地轻轻地处理细胞，且立即放入预热的完全培养基中。
--在15ml的锥形离心管里放入10ml预热的完全培养基
--把细胞从液氮中转移出来
--把盛有细胞的锥形瓶放入37℃水浴中并轻轻地搅拌直至所有的冰融化。
--立即用70%乙醇消毒锥形瓶
--立即把细胞转入含有预热培养基的锥形瓶以300×g离心5min
--吸取上清液并小心地在完全培养基中重悬细胞
--以2000-4000个细胞/cm2的细胞密度接种在由MatrigelTM或StemAdhereTM包被的细胞培养皿中，或即用型SynthemaxTM培养皿（Greiner）
--在37℃，5% CO2的湿润孵育器中孵育细胞
--每天通过更换75%培养基来培养细胞，余留25%含有细胞自分泌因子的培养基是非常重要的。
当达到大约70%的融合时继代细胞培养
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