RT-PCR常见问题分析及其解决方案
常见问题 | 可能原因 | 建议解决方案 |
少量或没有RT-PCR产物 | RNA被降解 | 分离无污染，高质量的RNA；提取RNA的材料要尽量新鲜，防止RNA降解；RT反应前，在变性胶上分析RNA的完整性；RNA提取后，应储存在100％甲酰胺中， 如果使用RNase抑制剂，加热时小于45℃；pH小于8.0，否则抑制剂会释放所有结合的RNase。而且， 在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。 |
逆转录抑制剂包括： SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐等；将对照RNA和样品混合，与对照RNA反应比较产量，以检验是否有抑制剂；通过70％乙醇对RNA沉淀进行清洗，除去抑制剂。 | ||
确定退火温度适合实验中所用的引物，对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟；对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。 | ||
增加RNA的量。对于小于50ng的RNA样品， 可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg－0.5μg乙酰BSA。 | ||
尝试其他组织 | ||
对两步法RT-PCR，在PCR步骤中的cDNA模板不能超过反应体积的1/5 | ||
产物有非特异性条带 | 引物和模板的非特异性退火 | 避免引物3'端含有2－3个dG或dC；在第一链合成中使用基因特异性引物，而不是随机引物或oligo(dT)；在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度；使用热启动Taq DNA酶进行PCR，提高反应的特异性。 |
遵循用于扩增引物设计的同样原则 | ||
使用扩增级DNaseⅠ处理RNA；设置没有逆转录的对照反应检测DNA污染。 | ||
设计在3'端没有互补序列的引物。 | ||
对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。 | ||
使用抗气雾剂的 吸头和UDG酶 | ||
产生弥散（smear）条带 | 第一链产物的含量过高 | 常规PCR反应步骤中减少第一链产物的量 |
PCR反应中引物过多 | 减少引物的用量 | |
循环数过多 | 优化PCR反应条件，减少PCR的循环次数 | |
退火温度过低 | 提高退火温度，防止非特异性的起始及延伸 | |
Dnase降解DNA是产生的寡 核苷酸片段产生的非特异性扩增 | 提取高质量RNA，防止被DNA污染 |
