逆转录RT-PCR常见问题分析
（一）RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 | |
可能原因 | 解决方案 |
RNA被降解 | 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA。 使用良好的无污染技术分离RNA。 在将组织从动物体取出后立刻处理。 |
RNA中包含逆转录抑制剂 | 通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%（体积分数）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg/μL到0.4μg/μL）以帮助小量样品RNA的恢复。 逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。 将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。 |
用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火 | 确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10min。 对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo（dT）或随机六聚体确定GSP是反义序列。 |
起始RNA量不够 | 增加RNA量。 |
RNA模板二级结构太多 | 将RNA和引物在不含盐及缓冲液的条件下变性/退火。 提高逆转录反应温度。 注意：不要在＞60℃时使用oligo（dT）引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。 对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。 |
（二）RT-PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。 | |
可能原因 | 解决方案 |
富含G+C的模板 | 对于G+C含量＞50%的模板，使用PCRx Enhancer Solution。 |
镁离子浓度太低 | 从1mmol/L到3mmol/L，间隔0.5mmol/L进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。 |
引物和模板非特异性退火 | 在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo（dT）。试用允许高温cDNA合成的GSP。 |
RNA中沾染了基因组DNA | 使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。 |
（三）PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误。 | |
可能原因 | 解决方案 |
聚合酶忠实性低 | 使用带有校正活性的热稳定聚合酶。 |
循环数太多 | 降低循环数。 |
