从不同动物组织中提取总DNA的方法及步骤（一）
1. 从动物组织中提取总DNA
a．取不超过25mg的组织(脾不超过10mg)，剪切成尽可能小的碎片，加入180微升样品裂解液A。
请勿使用过多的样品，过多的样品会导致抽提效果下降。较小的组织碎片会使裂解速度加快，裂解效果提高。新鲜或冻存的组织均可，但固定过的组织请参考后续的其它步骤进行。
b．加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀，55℃水浴孵育至完全裂解。
在孵育期间可以偶尔取出样品Vortex以加快裂解速度。裂解的时间因组织不同而有所不同，通常可在1-3小时内完成。为方便起见，可以直接裂解过夜，裂解过夜对抽提效果无任何负面影响。组织完全裂解后可以呈粘稠状，但不应该呈可把DNA纯化柱堵住的凝胶状。如果消化过夜仍呈凝胶状，说明样品用量过多，作为补救措施，可以把整个反应体系放大一倍。
c．清除RNA(可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度总DNA，加入4微升100mg/ml RNase A，Vortex混匀。室温(15-25℃)放置2分钟。
转录活性水平很高的组织例如肝和肾组织，RNA含量很高，在不做清除RNA的操作步骤(步骤1.c)的情况下，会导致最后获得的总DNA含有小部分RNA。如果残余的少量RNA对后续实验没有干扰，可以不进行本步实验操作，直接进入步骤d。
d．最高速剧烈Vortex 15秒。加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
加入样品裂解液B后需立即Vortex混匀。加入样品裂解液B后可能会产生白色沉淀，但大多数情况在70℃孵育后会溶解。即使70℃孵育后仍有白色沉淀也不会干扰后续实验。有些组织例如肺、脾，在加入样品裂解液B后可能会形成凝胶状物，此时需剧烈晃动或Vortex样品，以尽量破坏凝
胶状物。
e．加入200微升无水乙醇，Vortex混匀。
加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内。
f．把步骤e中的混合物加入到DNA纯化柱内。≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
注意：必须把沉淀全部转移到DNA纯化柱内，否则会严重影响抽提效果！
g．加入500微升洗涤液I，≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
h．加入600微升洗涤液II，≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
i．再≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟，以去除残留的乙醇。
不可把步骤h的离心时间延长而省略本步骤。倒弃废液后再离心可以确保充分去除残留的乙醇。
j．将DNA纯化柱置于一洁净的1.5ml离心管上，加入50-200微升洗脱液。室温放置1-3分钟。≥12000rpm离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA。
洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果有必要，可以使用去离子水或TE进行洗脱。使用较小体积的洗脱液可以使获得的总DNA的浓度较高，但洗脱下来的DNA量相对较少。如果对于获得较多量的DNA非常重要，可以在第一次用200微升洗脱液洗脱后，再用200微升洗脱液重复洗脱一次。第二次洗脱可以增加产量10-80%，特别是当第一次洗脱下来的DNA大于10微克时，第二次洗脱可以获得第一次洗脱时50-80%的量。一次性加入多于200微升的洗脱液对洗脱效果的改善相对不太明显。
2. 从鼠尾中抽提总DNA
a．取0.4-0.6cm的大鼠尾尖一段，或小鼠尾尖最多两段，加入180微升样品裂解液A。
小鼠尾尖最长不能超过1.2cm，大鼠尾尖不能超过0.6cm。如果使用的是成年大鼠或小鼠，建议仅使用0.4-0.6cm长的尾尖。如果抽提鼠尾的DNA用genotyping，使用0.2-0.3cm长的尾尖已经足够。
b．加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀，55℃水浴孵育至完全裂解。
在孵育期间可以偶尔取出样品Vortex以加快裂解速度。并确保鼠尾浸没在裂解液内。裂解完全通常需6-8小时。为方便起见，可以直接裂解过夜，裂解过夜对抽提效果无任何负面影响。组织完全裂解后可以呈粘稠状，但不应该呈可把DNA纯化柱堵住的凝胶状。如果消化过夜仍呈凝胶状，说明样品用量过多，作为补救措施，可以把整个反应体系放大一倍。
c．清除RNA(可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度总DNA，加入4微升100mg/ml RNase A，Vortex混匀。室温(15-25℃)放置2分钟。
鼠尾中RNA含量很低，但在不做清除RNA的操作步骤(步骤2.c)的情况下，会导致最后获得的总DNA含有少量的RNA。如果残余的少量RNA对后续实验没有干扰，可以不进行本步实验操作，直接进入步骤d。
d．按照等体积混合适当体积的样品裂解液B和无水乙醇，Vortex混匀。
每一个样品，需混合200微升样品裂解液B和200微升无水乙醇。如果有10个样品，则需混合2ml样品裂解液B和2ml无水乙醇，以此类推。配制好的样品裂解液B和无水乙醇的等体积混合液，室温放置，3个月内有效。必须Vortex充分混匀，否则会严重影响抽提效果。
e．最高速剧烈Vortex 15秒。加入400微升步骤d配制的样品裂解液B和无水乙醇等体积混合液，剧烈Vortex混匀。
加入样品裂解液B和无水乙醇的等体积混合液后可能会产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内，沉淀不会影响抽提效果。
f．把步骤e中的混合物加入到DNA纯化柱内。≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
注意：必须把沉淀全部转移到DNA纯化柱内，否则会严重影响抽提效果！
g．加入500微升洗涤液I，≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
h．加入600微升洗涤液II，≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
i．再≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟，以去除残留的乙醇。
不可把步骤h的离心时间延长而省略本步骤。倒弃废液后再离心可以确保充分去除残留的乙醇。
j．将DNA纯化柱置于一洁净的1.5ml离心管上，加入50-200微升洗脱液。室温放置1-3分钟。≥12000rpm离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA。
洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果有必要，可以使用去离子水或TE进行洗脱。使用较小体积的洗脱液可以使获得的总DNA的浓度较高，但洗脱下来的DNA量相对较少。如果对于获得较多量的DNA非常重要，可以在第一次用200微升洗脱液洗脱后，再用200微升洗脱液重复洗脱一次。第二次洗脱可以增加产量10-80%，特别是当第一次洗脱下来的DNA大于10微克时，第二次洗脱可以获得第一次洗脱时50-80%的量。一次性加入多于200微升的洗脱液对洗脱效果的改善相对不太明显。
