从不同动物组织中提取总DNA的方法及步骤（二）
3. 从培养的动物细胞中抽提总DNA
a．收集最多不超过500万的细胞，离心沉淀后重悬于200微升PBS中。
PBS需自备。如果使用冻存的细胞沉淀，先把细胞沉淀解冻，并轻轻弹散，然后再加入PBS。对于基因组DNA含量较高的细胞，例如Hela细胞，应使用较少的细胞，例如100-200万Hela细胞。
b．清除RNA(可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度总DNA，加入4微升100mg/ml RNase A，Vortex混匀。室温(15-25℃)放置2分钟。
在不做清除RNA的操作步骤(步骤3.b)的情况下，会导致最后获得的总DNA含有小部分RNA。如果残余的少量RNA对后续实验没有干扰，可以不进行本步实验操作，直接进入步骤c。
c．加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀。
d．加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
加入样品裂解液B后必须立即Vortex混匀。不可把蛋白酶K直接和样品裂解液B混合。
e．加入200微升无水乙醇，Vortex混匀。
加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能会产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内。
f．把步骤e中的混合物加入到DNA纯化柱内。≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
注意：必须把沉淀全部转移到DNA纯化柱内，否则会严重影响抽提效果！
g．加入500微升洗涤液I，≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
h．加入600微升洗涤液II，≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
i．再≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟，以去除残留的乙醇。
不可把步骤h的离心时间延长而省略本步骤。倒弃废液后再离心可以确保充分去除残留的乙醇。
j．将DNA纯化柱置于一洁净的1.5ml离心管上，加入50-200微升洗脱液。室温放置1-3分钟。≥12000rpm离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA。
洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果有必要，可以使用去离子水或TE进行洗脱。使用较小体积的洗脱液可以使获得的总DNA的浓度较高，但洗脱下来的DNA量相对较少。如果对于获得较多量的DNA非常重要，可以在第一次用200微升洗脱液洗脱后，再用200微升洗脱液重复洗脱一次。第二次洗脱可以增加产量10-80%，特别是当第一次洗脱下来的DNA大于10微克时，第二次洗脱可以获得第一次洗脱时50-80%的量。一次性加入多于200微升的洗脱液对洗脱效果的改善相对不太明显。
4. 从动物血液中抽提总DNA
本操作方法也适用于血沉棕黄层(buffy coat)和骨髓(bone marrow)的总DNA抽提。
a．取50-100微升红细胞无细胞核的血，或5-10微升活细胞有细胞核的血。
人、猴、牛、兔、大鼠、小鼠等的红细胞无细胞核，鸟、鱼、蛙等的红细胞有细胞核。红细胞有细胞核会导致相同体积的血液内DNA的含量非常高。
b．加入20微升蛋白酶K。
c．加入PBS至总体积为220微升，Vortex混匀。
d．加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
e．转步骤3.e。后续步骤同“从培养的动物细胞中抽提总DNA”3.e起的步骤。
5. 从石蜡包埋的组织样品中抽提总DNA
由于包埋的组织通常已经被固定，通常仅能获得长度小于650bp的DNA。乙醇或甲醛固定的石蜡包埋组织样品相对比较适合DNA的抽提，而有交联作用的固定试剂(例如锇酸)固定的组织则不适合用于抽提DNA。需自备二甲苯。
a．取一块小于25mg的包埋块，加入1.2ml二甲苯，剧烈Vortex，以充分脱腊。
b．台式离心机最高速(12000-14000rpm)室温离心5分钟，弃上清。
注意，去除上清的时候要非常小心，不要把沉淀丢失了。
c．加入1.2ml无水乙醇，轻轻Vortex混匀，以去除残留的二甲苯。
d．台式离心机最高速(12000-14000rpm)室温离心5分钟，弃上清。
注意，去除上清的时候要非常小心，不要把沉淀丢失了。
e．重复步骤c和d一次，即再用乙醇洗涤样品一次。
f．弃上清后再最高速离心1分钟，用20微升枪小心吸除残留的液体。
g．室温放置数分钟至乙醇全部挥发。
h．加入180微升样品裂解液A。
i．转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
6. 从甲醛固定的组织中抽提总DNA
由于组织已经被固定，通常仅能获得长度小于650bp的DNA。甲醛或乙醇固定的组织样品相对比较适合DNA的抽提，而有交联作用的固定试剂(例如锇酸)固定的组织则不适合用于抽提DNA。乙醇固定的组织可以参考甲醛固定的组织的抽提方法进行总DNA的抽提。
a．取不超过25mg的组织，用PBS洗涤两次，以充分去除固定液。
b．去除PBS，转步骤1.a，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.a起的步骤。
7. 从革兰氏阴性菌中抽提总DNA
a．离心收集最多不超过20亿个细菌，弃上清。
b．加入180微升样品裂解液A，充分重悬细菌。
c．转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
8. 从革兰氏阳性菌中抽提总DNA
需自备溶菌酶，并配制溶菌酶溶液：20mM Tris，pH8.0，2mM EDTA，1.2% Triton X-100，20mg/ml溶菌酶。溶菌酶在临使用前加入。
a．离心收集最多不超过20亿个细菌，弃上清。
b．用180微升溶菌酶溶液充分重悬细菌。
c．37℃孵育30分钟以裂解细菌。
d．加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀。
e．加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。
不可把蛋白酶K直接加入到样品裂解液B中。
f．70℃孵育30分钟。
g．转步骤1.e，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.e起的步骤。
9. 从酵母中抽提总DNA
需自备用于裂解酵母的酶lyticase，并配制酵母裂解液：1M 山梨糖醇(sorbitol)，100mM EDTA，14mM 2-巯基乙醇。
a．离心收集最多不超过50万个酵母，弃上清。
b．用600微升上述酵母裂解液重悬，加入200U lyticase，30℃孵育30分钟。
注意：裂解的时间会随酵母的种类不同而有所不同，详细情况请参考lyticase的说明书。
c．300g离心10分钟收集沉淀，弃上清。
d．沉淀用180微升样品裂解液A重悬。
e．转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
10. 从昆虫中抽提总DNA
a．用液氮冷冻后研碎处理：
a).取最多不超过50mg昆虫(例如果蝇)，液氮冷冻后研碎，转移至1.5ml离心管中。
b).加入180微升样品裂解液A。
c).转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
b．用匀浆器匀浆处理：
a).取最多不超过50mg昆虫(例如果蝇)。
b).加入180微升PBS，用电动匀浆器或玻璃匀浆器匀浆。
c).转步骤3.b，后续步骤同“从培养的动物细胞中抽提总DNA”3.b起的步骤。
11. 从其它样品中抽提总DNA
对于某些样品需使用特定的裂解液裂解，可以参考如下方法进行总DNA的抽提。
a．样品用200微升特定的裂解液裂解。裂解需确保呈溶液状态，如果有不溶物需通过离心沉淀去除。
b．加入20微升蛋白酶K。
c．加入200微升样品裂解液B，立即Vortex混匀。
d．70℃孵育10分钟。
检查整个溶液的pH值，确保pH值小于7.0，否则DNA结合到纯化柱的效率会很低。
e．转步骤1.e，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.e起的步骤。
