HbA1c: 标准化以及临床实验室检测
学习目的
1. 了解美国糖尿病的差异情况
2. 理解平均血糖与血红蛋白A1c（HbA1c）值之间的相关性
3. 了解美国与国际HbA1c标准化工作情况
4. 描述一些常用的临床实验室HbA1c检测方法
5. 列举HbA1c作为长期平均血糖浓度的评估手段时所存在的一些潜在干扰与问题
一名住在美国东南部的14岁非洲裔美国男孩在深夜被其父母送进急诊科，主诉有长期口渴、偶尔呕吐、疲乏以及尿频等症状。
而这些症状在最近几个星期里变得越来越严重。接诊该患者的急诊科医师要求进行高血糖以及糖尿病酮症酸中毒的急诊实验室检测（表1）。
按照美国糖尿病协会（ADA）的指南标准，该男孩所患的是伴有急性代谢失调的高血糖所导致的糖尿病。
最终该患者被诊断为Ⅰ型糖尿病，随后被转入医院进行胰岛素和营养控制治疗。自此，对该患者要求其进行自我血糖监测，并且每三个月由内分泌科医生进行随访，同时推荐进行HbA1c测试。
此后在第一次随访就诊时，该患者向内分泌科医生提供了其前三个月的自我监测的血糖值。另外，在随访前两天，医院实验室为患者测试了HbA1c，结果也提供给了医生。依据病人自我监测的血糖值（每天测试6-7次）计算显示其过去三个月的平均血糖值为205mg/dL（11.5mmol/L）。
然而，随访前两天测试的HbA1c值却显示为6.5%，反映出患者前两三个月的平均血糖值大约为153mg/dL（8.6mmol/L），这与病人自我监测的血糖值存在着较大的差异。
内分泌医生后来采集了病人就诊当天的样品来确认其HbA1c值。检测发现病人的HbA1c值和平均血糖值之间存在着差异，这种差异并非因血糖监测间隔期间的低血糖发作或者是夜间低血糖所致。
这一现象提示了医生去检查是否有潜在的导致红细胞（RBC）存活率降低的疾病存在，因为这类疾病的存在会引发HbA1c值减低的假象。一项特别针对该患者的Hb电泳测试显示了有HbC变异存在，提示这一不正常的Hb与RBC寿命缩短有关。
本文目的在于回顾糖尿病与HbA1c之间的联系，阐述作为平均血糖浓度的长期监控指标的HbA1c值测试的标准化工作，以及HbA1c的病理学和现行的临床实验室测试方法的不足之处。
糖尿病以及HbA1c的背景
现今在发达国家，糖尿病是第七大导致患者死亡的疾病。在美国，每年用于这一痛苦疾病的医疗保健支出高达1320亿美元；预计到2020年，这一费用将上升到1920亿美金（见图1）。根据ADA的描述，糖尿病被定义为“一组新陈代谢疾病，其特征为由胰岛素分泌缺乏或/和胰岛素抵抗所引起的血糖增高。
糖尿病的慢性高血糖症会导致长期的损害、机能障碍、多种器官衰竭等，其中眼、肾、神经、心脏以及血管等器官尤为严重。”这一疾病所导致的血糖水平升高源于胰岛素分泌缺乏（Ⅰ型）或由胰岛素抵抗所引起的（Ⅱ型），或者两者皆有。其结果是导致长期的医学并发症的出现，并进而增加了这一痛苦疾病所需的费用。
糖尿病病人如何不控制其血糖浓度就可能导致出现严重的医学并发症以及早产儿死亡。
包括1983-1993年进行的糖尿病控制与并发症试验（DCCT）和1990年进行的最大规模针对糖尿病的英国糖尿病前瞻性研究（UKPDS）在内的临床糖尿病研究都已证实，不论是Ⅰ型还是Ⅱ型糖尿病，其血糖控制水平都与晚期的视网膜、肾脏以及神经系统并发症的发生有着高度的相关性。
DCCT的研究进一步表明，如果Ⅰ型糖尿病患者将平均血糖浓度维持在一个接近正常的水平，那么其发生微血管并发症的概率就会大大降低；而UKPDS的研究所得出的一个确切结论就是Ⅱ型糖尿病所出现的危及生命的并发症也能通过例如采用降低平均血糖值等适当的治疗措施来大大降低其发生率。
来自这些大规模前瞻性随机临床试验的结果显示强化以达到正常血糖水平（或者说至少尽可能地接近正常）为目标的治疗可以降低糖尿病并发症的发生频率和严重性。重要的是，虽然有一些病人的数据与之相反，但是更多更充分的数据显示HbA1c值的升高与糖尿病并发症的发生有着直接关系。
这是由DCCT与UKPDS针对平均血糖控制对个体血浆葡萄糖浓度的HbA1c测试进行分析后得出的结论。基于HbA1c与糖尿病并发症之间的直接关系，最近有一些用于糖尿病管理的指南开始强调HbA1c监控的重要性。
作为一种对长期平均血糖的评估指标，HbA1c的检测可以帮助患者以及医生确定治疗目标，以降低糖尿病慢性并发症的发生以及发展的概率。
DCCT的研究结果显示了HbA1c值与平均血糖浓度之间的强相关性。比如当HbA1c值为7%时，平均血糖浓度大约为170mg/dL（8.3mmol/L）；而当HbA1c值为9%时，平均血糖浓度大约为240mg/dL（11.7mmol/L）。
另外，DCCT以及UKPDS试验使ADA针对成年糖尿病患者推荐了一项重要的治疗目标，即使用DCCT同样的方法（阳离子交换高效液相色谱）进行检测时HbA1c应为接近正常血糖水平的<7%。
这样做不仅是为了强调作为DCCT和UKPDS试验结果所使用的特定方法测试HbA1c值的巨大意义，也是因为意识到了当时临床所使用的多种方法会带来的巨大可变性。
在所有临床实验室施行HbA1c测试的标准化将有助于糖尿病患者的治疗和监控，这一努力结果在1996年催生了美国国家糖化血红蛋白标准化项目（NGSP）。
美国HbA1c的标准化工作
1993年，DCCT试验完成后，HbA1c测试的标准化就显得日趋重要。因为通过研究证实，HbA1c检测的标准化建立对于糖尿病患者治疗的正面影响是显而易见的。美国临床化学协会（AACC）标准化委员会在1993年4月设立了一个国家糖化血红蛋白标准化委员会，目前简称为NGSP。
就在DCCT的结果公布之时，虽然临床实验室检测HbA1c的方法五花八门，但却没有能作为标准测试的参考方法。这导致了不同实验室报出的结果以及不同时间得出的结论都有着相当大的出入。
1993年，临床实验室HbA1c的检测分析状况相当混乱。由美国病理学家学会（CAP）在当年所作的精确调查显示，不同的检测方法中存在着巨大的偏差和不精确。举例来说，1993年，一位病人在一家医院测试的HbA1c值为9%，而在另一家医院采用同一份样品得出的结果却达到了16%。
而NGSP的制定就是为了使HbA1c测试标准化，让每个独立的临床实验室的分析结果能够和诸如DCCT或UKPDS这种大型研究结果相一致，即HbA1c值与平均血糖浓度以及慢性糖尿病并发症的发展有关联。1996年，NGSP开始为达成这一目标着手HbA1c测试的标准化工作。
NGSP旗下的实验室网络当时采用了一系列的测试方法，每个方法的校准均采用DCCT用来量化HbA1c的阳离子交换HPLC作为中间参考方法。ADA建议所有开展HbA1c测定的实验室参加CAP精确测定调查。
为了有助于HbA1c标准化工作进一步的开展，从1996年开始CAP调查就使用拥有通过NGSP目标值的新鲜全血样品进行测试。随着1996年NGSP工作的开始，调查就显示不论是方法间还是方法内，各实验室之间的HbA1c值的可变性都有了稳定的进步。
总之，NGSP认证的方法被证实更为稳定，与NGSP认定的目标值更为接近。
依照CAP的调查结果，2007年已有99%的实验室使用NGSP认证的方法报告HbA1c的结果，而在1995年这一比例为0%。更多的信息可登陆www.ngsp.org，寻找NGSP认证过程以及NGSP认证方法和实验室清单。
国际标准化工作
国际临床化学联合会（IFCC）在1995年启动了一项全球性的HbA1c的标准化行动。当NGSP在美国推动HbA1c标准化工作的同时，IFCC则建立了一个工作组以推动达到一个统一的国际HbA1c标准化的目的，同时其也制定了明确的糖化血红蛋白测试的参考方法提供给NGSP作为新的标准目标。
为了确切测试血红蛋白（HbA1c）β链N-端残基的糖化，有两套参考方法被付诸实施。这两种方法首先都要将血液用盐水进行洗涤，然后将红细胞置于氯化钠溶液中37℃以下孵育4个小时，最后再用水将红细胞溶解。
接下来要做的是将溶血后产物置于蛋白内切酶Glu-C中37℃孵育18个小时，使Hb裂解为多肽，最后用毛细管电泳或者电喷雾离子阱质谱法来测定Hbβ链N-端多肽的糖化与否。这些参考方法已在2001年获IFCC批准。
虽然这些方法非常精确，但却是费时、技术难度高、步骤繁琐以及费用昂贵，因此并不适合常规临床实验室使用。
IFCC已经取得了重要的进展。她不仅开发出了HbA1c测试参考程序、准备了高纯度的HbA1c参考材料，同时也建立一个参考实验室网络，并与NGSP以及其他网络组织进行了对比。然而IFCC与NGSP的测试方法采用新的IFCC校准标准后显示IFCC的结果始终要低大约1.5%-2%。
针对这一问题，对IFCC以及NGSP的相关性进行评估后制定了一个方程式来解决。这一方程式能够将IFCC的结果与DCCT以及UKPDS所得出的有着重要意义的临床HbA1c结果联系起来。
虽然IFCC/NGSP之间的相关性非常好，但其绝对数并不相同，因而把这一校准标准引入临床实验室将有可能给病人和临床医生带来巨大的混乱。所以在这一项目上，IFCC工作组的立场是避免混乱，同时建议使用IFCC/NGSP主方程式将NGSP单位%换算为参考标准中的单位mmol HbA1c/mol Hb后再进行报告。
事实上，在应该采用哪个数据来报告这个问题上一直存在着很大的争议。ADA、欧洲糖尿病研究协会（EASD）、国际糖尿病联合会（IDF）和一些其他国家的成员组织目前提供的是与DCCT/UKPDS数据直接相关的病人保健指南。
其结果是在2004年成立了ADA/EASD/IDF的Alc测试工作小组以协调HbA1c的报告形式。2007年10月，IFCC以及ADA/EASD/IDF工作组发表了一项联合声明，一致同意HbA1c的测试结果应该做到全球标准化，这其中也包括参考系统以及结果报告形式。
该工作组声称IFCC新的HbA1c的参考系统是唯一有效的达成测试标准化的手段，并建议HbA1c的测试结果采用全球通用的IFCC单位（mmol HbA1c/mol Hb）并且使用IFCC/NGSP主方程式NGSP单位（%）。此外，一项“平均血浆葡萄糖浓度”的研究正在进行中。
如果这一研究达到了其特定的标准，那么一项从HbA1c结果中衍生的HbA1c平均血糖指标（ADAG）也将被作为HbA1c的解释来报告。联合声明还声称所有临床指南中的胰岛素水平都应该使用IFCC单位以及转化的NGSP单位来表达，ADAG值也一样。
HbA1c以及Hb变异体的病理学
糖化作用是一种非酶参与的糖分子与蛋白质氨基的结合反应。当葡萄糖与β链N-端缬氨酸中的一条或两条结合形成希夫碱时，血红蛋白（Hb）的糖化就发生了。这一快速却不稳定的过程随后会缓慢形成一个不可逆的氨基酮（阿马多尔重排）。
这一稳定的氨基酮形成将影响红细胞的生存期。糖化血红蛋白（GHb），有时也被称之为血红蛋白Alc（HbA1c）、糖血红蛋白、HbA1或Alc，都是用来描述Hb与葡萄糖非酶结合缓慢形成的一系列稳定的次要Hb成分。
为了消除关于GHb以及临床实验室测试之间的术语混乱，美国临床生化学会（NACB）的指南建议使用“Alc测试”作为有关糖尿病诊断以及管理的实验分析术语。
HbA1，包括HbA1a、HbA1b以及HbA1c，其名字都是因为它们的快速洗脱性质可以通过阳离子交换色谱法定量测试而得来的。
HbA1a以及HbA1b仅占HbA1的大约20%，HbA1c才是HbA1最主要成分，占剩余的80%左右。血红蛋白的糖化作用符合质量作用定律，因此糖化作用的程度可以通过测试血红蛋白的浓度以及血糖升高的持续时间以及程度来确定。在GHb中，HbA1c可以反映出糖化情况，所以它是GHb中被研究的最多的一项。
HbA1c值不仅仅受血糖浓度的影响，同时也与红细胞的生存有关。HbA1c的合成速率与超过平均120天生命周期的红细胞糖化量成函数关系。这一关系为临床提供了一项有用的指数，即过去120天内的平均血糖指数。
一个在过去3个月内血糖浓度正常的人（60mg/dL-100mg/dL，3.5mmol/L-5.5mmol/L）其HbA1c值应该＜6.5。DCCT中的几项研究证实了这一发现，这也促使ADA建立了现行的HbA1c与平均血糖浓度的关系标准（表2）。
然而考虑到病人的红细胞生存期可能会有变化（缩短或延长），这就使得糖尿病管理指南中所使用的这一关系可能就不那么有效。举例来说，当血细胞生存期缩短时可导致衰老的红细胞数目不成比例，此时与平均血糖浓度相比就可能得出HbA1c值的假性偏高。
这种情况可能在缺乏铁、维生素B12以及叶酸的病人身上出现。与之相反的是过快的红细胞周转会导致新生红细胞的比例过大而产生假性低HbA1c值。这一情况多见于溶血病人和那些治疗铁、维生素B12以及叶酸缺乏的病人，或者是那些带有诸如HbS或HbC等Hb变异体的病人身上。
现在还没有建立起用于HbA1c与变化的RBC生存期之间关系的指导标准。此外，在一些情况下当Hb分子出现突变时（Hb变异体），一些方法学可能会产生明显的HbA1c值的偏差。这一偏差已被证实取决于所使用的方法这和特定的Hb变异。
目前已确定的Hb变异体超过了975个。除了对RBC生存期的影响，这些变异体也可能会干扰到HbA1c的分析。根据所采用的特定方法和变异体的存在，HbA1c值有可能会出现假性升高或降低。
比如，如果不能有效地解决Hb变异体的问题，就将导致离子交换HbA1c测试方法出现严重的错误结果。
更为重要的是，如果Hb变异体改变了RBC的生存期，其影响将会更大。不论HbA1c检测的标准化工作取得多大进展，Hb变异体的存在都会长期成为影响采用HbA1c值评估病人平均血糖浓度的准确性的一个巨大障碍。
HbA1c的临床实验室分析
目前用来检测HbA1c的商品化方法多达30种以上。其中最常用的两种测试原理是基于HbA1c的电荷差（离子交换层析法和电泳法）和结构差异（硼酸基亲和层析法和免疫法）。按照1995年CAP调查，54%的实验室报道的HbA1c值都是采用亲和层析法。
有趣的是，2007年CAP的调查却给出了一个彻底的改变，大部分实验室（超过97%）都开始使用免疫法和离子交换法，这些方法的确是更适合于常规临床实验室使用。这一巨大的改变在另一方面说明了HbA1c测试正越来越多地作为平均血糖值控制评估指示被使用着。
DCCT制定的糖尿病管理的指导方针强调了HbA1c值的重要性，同时也强化了那些非经典方法的操作特点，尤其是不为人注意的诸如由HbS和HbC等常见Hb变异体所引起的错误的HbA1c测试结果。
按照2007年的CAP调查，离子交换层析法，也就是通过电荷差异将Hb类物质分离的一种方法，占了HbA1c检测方法的大约32%以上。这其中最为典型的是阳离子交换层析法。它是根据电荷的不同，用离子浓度强的缓冲液在不同的时间将Hb族从阳离子交换柱中洗脱下来。
洗脱后检测Hb的浓度，通过计算每个峰值下的面积并根据浓度来定量HbA1c。通常，Hb分子的变化或突变会导致其与野生型Hb族的电荷不同，这有可能会在采用阳离子交换层析法时改变这类Hb的正常洗脱时间。
表3显示了在一个己知样品中用于测定HbA1c值的方程式，并说明了当Hb变异体不能从HbA或HbA1c中分离出来时Hb洗脱时间的变化对HbA1c值的影响。
虽然在一些离子交换层析法中改变流动相的离子强度可以减少一些常见的Hb变异体（HbS和HbC）的共同洗脱水平，但仍然建议临床医生考虑采用其他方法来取代HbA1c作为平均血糖浓度评估的手段，例如糖化白蛋白或者果糖胺，从而避免在为病人解释其HbA1c值时引起困扰。
硼酸基亲和层析法是另一项在临床实验室一直使用的HbA1c测试方法。这一方法可以区分糖基化血红蛋白族的结构差异，并被证实在所有的商用方法中是受Hb变异体和衍生物存在干扰影响最小的方法。该方法可被用来测试总GHb、HbA1c以及在Hbα和β链赖氨酸以及N-端缬氨酸上形成的氨基酮结构。
这一测试原理是将总GHb固定于包含有交联琼脂糖或玻璃珠的m-氨基苯硼酸的柱子中。通过山梨醇分离复合物，并将所有的GHb洗脱出来。接下来可以用分光光度仪或通过荧光淬火法来检测总GHb和HbA1c。有报道称一种商品化检测方法不受Hb变异体或衍生物的干扰。
然而其它的商品化方法在测试有HbAC和HbCC变异的样品时对总GHb值仍存在影响。2007年CAP调查显示，采用硼酸基亲和层析法监测GHb值要比采用其它方法多2%。
据2007年CAP调查，免疫比浊法是目前用来测试HbA1c值最常用的方法（65%）。该方法采用的是抗体介导的乳胶凝集抑制原理来定量测定HbA1c。其使用的单克隆或多克隆抗体可以识别血红蛋白β-链上N末端糖基化的前4-10个氨基酸，但这些抗体不能识别可逆的希夫碱或其它的GHb族。
不幸的是，当采用能识别Hb β链上第6位氨基酸的抗体时，最容易受到的干扰就是来自最常碰到的Hb突变体HbS（Hb β链氨基酸6，Glu＞Val）和HbC（Hb β链氨基酸6，Glu＞Lys）。其它一些已经被证明可以导致HbA1c值降低的Hb还包括HbF、Hb Graz以及Hb Raleigh。
任何能导致Hb β链N末端前4-10个氨基酸改变的变异体都会在使用这些抗体进行测试时带来错误结果。然而事实上有些方法并不受这些常见Hb变异体的影响。在www.ngsp.org 网站上我们可以找到一份列举了11种常见免疫比浊法测试HbA1c的资料，以及在常见Hb变异体存在的情况下有关测试精确度的研究清单。
为了减少Hb变异体给免疫比浊法测试HbA1c所带来的错误，越来越多的商家的产品中所采用的单抗只针对Hb β链第2位氨基酸的糖化形式。虽然免疫比浊法给临床实验室带来低成本和自动化的优势，但这种方法显而易见的问题是可能无法区别病人体内所有的Hb变异体。
离子交换层析法以及硼酸基亲和层析法有时还能检测出Hb变异体，相比较则言，免疫比浊的“封闭管”结构使用户不能从Hb洗脱产物或样本中区别出伪造的变异体来。基于这一原因，在Hb变异体发生率较高的人群中，选择免疫比浊法时应该慎之又慎。
推荐在做HbA1c测试时，考虑或需要评估有Hb变异体存在的指标为HbA1c＞15%或更多。另外，如果你所在实验室所用的方法受到Hb变异体的干扰时，建议使用其它的方法。最后，如果Hb变异体会改变RBC的生存期，那么应该考虑用诸如糖化白蛋白或果糖胺等替代品作为平均血糖浓度的评估手段。
可惜的是，还没有像研究HbA1c这样的大型临床研究对糖化白蛋白和果糖胺值在慢性糖尿病并发症风险评估中的价值进行过调查。
从数据上看，离子交换层析法和免疫比浊法是最常用的测试HbAlc的方法。虽然这些方法中的大部分都不受常见杂合子变异体的影响，但现在却没有一个明确的指导标准供临床医生和糖尿病患者参考。
特别是对于一些没有HbA存在的糖尿病患者，诸如纯合子HbS,HbC或HbSC疾病，由于受到RBC的生存期的影响以及体内氨基末端β链的糖化，因而所有检测HbA1c方法作为平均血糖浓度的评估都是不合适的。
这也是出现文章开头所描述的患者情况的原因。该患者除了患有糖尿病外还有HbC疾病。HbC变异体导致病人RBC的生存期缩短，并最终引起HbA1c值的降低。
总结与结论
本文主要阐述了糖尿病与HbA1c之间的关联、HbA1c作为长期平均血糖浓度监控指标的标准化工作和HbA1c的病理学以及当前临床实验室所采用的测试方法的缺陷。
包括DCCT以及UKPDS在内的长期研究表明，平均血糖浓度（HbA1c）和糖尿病并发症的严重性有关，因此告知临床医生和糖尿病患者可通过测试HbA1c值来减少问题的发生。这进一步加快了所有进行HbA1c测试的临床实验室的标准化工作的进行。通过他们的努力，HGSP和IFCC已经为达到这一目标铺平了道路。
尽管取得了一些进展，但由于Hb变异体的存在，许多现行的HbA1c测试方法还是受到了特别的限制。在一些Hb变异体的高发区，必须要慎重地选择HbA1c测试方法，以避免一些不必要的错误。
在这些可能导致HbA1c不准确的人群中建议使用其它的替代方法（如：糖化白蛋白和果糖胺）对平均血糖测试进行监控。但目前还没有对这些人群和这些方法进行过系统的研究，故尚无可供临床医生和患者参考的指南。
所以，临床医生在采用糖化白蛋白和果糖胺对长期平均血糖浓度进行评估时应该非常的谨慎。首先，糖化白蛋白和果糖胺只能评估过去2周内的糖化情况，而不是像HbA1c可以评估过去2-3个月的情况。另外，糖化白蛋白与果糖胺与糖尿病长期并发症发展进程之间的关联不像HbA1c那样强。
参考文献（略）
作者简介：Ross J. Molinaro,PhD,MT（ASCP），美国亚特兰大Emory大学医学院病理和检验医学系临床生化专家。
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