HbA1c: 标准化以及临床实验室检测 （一）
学习目的：
1. 了解美国糖尿病的差异情况
2. 理解平均血糖与血红蛋白A1c（HbA1c）值之间的相关性
3. 了解美国与国际HbA1c标准化工作情况
4. 描述一些常用的临床实验室HbA1c检测方法
5. 列举HbA1c作为长期平均血糖浓度的评估手段时所存在的一些潜在干扰与问题
一名住在美国东南部的14岁非洲裔美国男孩在深夜被其父母送进急诊科，主诉有长期口渴、偶尔呕吐、疲乏以及尿频等症状。而这些症状在最近几个星期里变得越来越严重。接诊该患者的急诊科医师要求进行高血糖以及糖尿病酮症酸中毒的急诊实验室检测（表1）。按照美国糖尿病协会（ADA）的指南标准，该男孩所患的是伴有急性代谢失调的高血糖所导致的糖尿病。最终该患者被诊断为Ⅰ型糖尿病，随后被转入医院进行胰岛素和营养控制治疗。自此，对该患者要求其进行自我血糖监测，并且每三个月由内分泌科医生进行随访，同时推荐进行HbA1c测试。
此后在第一次随访就诊时，该患者向内分泌科医生提供了其前三个月的自我监测的血糖值。另外，在随访前两天，医院实验室为患者测试了HbA1c，结果也提供给了医生。依据病人自我监测的血糖值（每天测试6-7次）计算显示其过去三个月的平均血糖值为205mg/dL（11.5mmol/L）。然而，随访前两天测试的HbA1c值却显示为6.5%，反映出患者前两三个月的平均血糖值大约为153mg/dL（8.6mmol/L），这与病人自我监测的血糖值存在着较大的差异。
内分泌医生后来采集了病人就诊当天的样品来确认其HbA1c值。检测发现病人的HbA1c值和平均血糖值之间存在着差异，这种差异并非因血糖监测间隔期间的低血糖发作或者是夜间低血糖所致。这一现象提示了医生去检查是否有潜在的导致红细胞（RBC）存活率降低的疾病存在，因为这类疾病的存在会引发HbA1c值减低的假象。一项特别针对该患者的Hb电泳测试显示了有HbC变异存在，提示这一不正常的Hb与RBC寿命缩短有关。
本文目的在于回顾糖尿病与HbA1c之间的联系，阐述作为平均血糖浓度的长期监控指标的HbA1c值测试的标准化工作，以及HbA1c的病理学和现行的临床实验室测试方法的不足之处。
糖尿病以及HbA1c的背景
现今在发达国家，糖尿病是第七大导致患者死亡的疾病。在美国，每年用于这一痛苦疾病的医疗保健支出高达1320亿美元；预计到2020年，这一费用将上升到1920亿美金（见图1）。根据ADA的描述，糖尿病被定义为“一组新陈代谢疾病，其特征为由胰岛素分泌缺乏或/和胰岛素抵抗所引起的血糖增高。糖尿病的慢性高血糖症会导致长期的损害、机能障碍、多种器官衰竭等，其中眼、肾、神经、心脏以及血管等器官尤为严重。”这一疾病所导致的血糖水平升高源于胰岛素分泌缺乏（Ⅰ型）或由胰岛素抵抗所引起的（Ⅱ型），或者两者皆有。其结果是导致长期的医学并发症的出现，并进而增加了这一痛苦疾病所需的费用。
糖尿病病人如何不控制其血糖浓度就可能导致出现严重的医学并发症以及早产儿死亡。包括1983-1993年进行的糖尿病控制与并发症试验（DCCT）和1990年进行的最大规模针对糖尿病的英国糖尿病前瞻性研究（UKPDS）在内的临床糖尿病研究都已证实，不论是Ⅰ型还是Ⅱ型糖尿病，其血糖控制水平都与晚期的视网膜、肾脏以及神经系统并发症的发生有着高度的相关性。DCCT的研究进一步表明，如果Ⅰ型糖尿病患者将平均血糖浓度维持在一个接近正常的水平，那么其发生微血管并发症的概率就会大大降低；而UKPDS的研究所得出的一个确切结论就是Ⅱ型糖尿病所出现的危及生命的并发症也能通过例如采用降低平均血糖值等适当的治疗措施来大大降低其发生率。
来自这些大规模前瞻性随机临床试验的结果显示强化以达到正常血糖水平（或者说至少尽可能地接近正常）为目标的治疗可以降低糖尿病并发症的发生频率和严重性。重要的是，虽然有一些病人的数据与之相反，但是更多更充分的数据显示HbA1c值的升高与糖尿病并发症的发生有着直接关系。这是由DCCT与UKPDS针对平均血糖控制对个体血浆葡萄糖浓度的HbA1c测试进行分析后得出的结论。基于HbA1c与糖尿病并发症之间的直接关系，最近有一些用于糖尿病管理的指南开始强调HbA1c监控的重要性。作为一种对长期平均血糖的评估指标，HbA1c的检测可以帮助患者以及医生确定治疗目标，以降低糖尿病慢性并发症的发生以及发展的概率。
DCCT的研究结果显示了HbA1c值与平均血糖浓度之间的强相关性。比如当HbA1c值为7%时，平均血糖浓度大约为170mg/dL（8.3mmol/L）；而当HbA1c值为9%时，平均血糖浓度大约为240mg/dL（11.7mmol/L）。另外，DCCT以及UKPDS试验使ADA针对成年糖尿病患者推荐了一项重要的治疗目标，即使用DCCT同样的方法（阳离子交换高效液相色谱）进行检测时HbA1c应为接近正常血糖水平的<7%。这样做不仅是为了强调作为DCCT和UKPDS试验结果所使用的特定方法测试HbA1c值的巨大意义，也是因为意识到了当时临床所使用的多种方法会带来的巨大可变性。在所有临床实验室施行HbA1c测试的标准化将有助于糖尿病患者的治疗和监控，这一努力结果在1996年催生了美国国家糖化血红蛋白标准化项目（NGSP）。
美国HbA1c的标准化工作
1993年，DCCT试验完成后，HbA1c测试的标准化就显得日趋重要。因为通过研究证实，HbA1c检测的标准化建立对于糖尿病患者治疗的正面影响是显而易见的。美国临床化学协会（AACC）标准化委员会在1993年4月设立了一个国家糖化血红蛋白标准化委员会，目前简称为NGSP。就在DCCT的结果公布之时，虽然临床实验室检测HbA1c的方法五花八门，但却没有能作为标准测试的参考方法。这导致了不同实验室报出的结果以及不同时间得出的结论都有着相当大的出入。
1993年，临床实验室HbA1c的检测分析状况相当混乱。由美国病理学家学会（CAP）在当年所作的精确调查显示，不同的检测方法中存在着巨大的偏差和不精确。举例来说，1993年，一位病人在一家医院测试的HbA1c值为9%，而在另一家医院采用同一份样品得出的结果却达到了16%。而NGSP的制定就是为了使HbA1c测试标准化，让每个独立的临床实验室的分析结果能够和诸如DCCT或UKPDS这种大型研究结果相一致，即HbA1c值与平均血糖浓度以及慢性糖尿病并发症的发展有关联。1996年，NGSP开始为达成这一目标着手HbA1c测试的标准化工作。
NGSP旗下的实验室网络当时采用了一系列的测试方法，每个方法的校准均采用DCCT用来量化HbA1c的阳离子交换HPLC作为中间参考方法。ADA建议所有开展HbA1c测定的实验室参加CAP精确测定调查。为了有助于HbA1c标准化工作进一步的开展，从1996年开始CAP调查就使用拥有通过NGSP目标值的新鲜全血样品进行测试。随着1996年NGSP工作的开始，调查就显示不论是方法间还是方法内，各实验室之间的HbA1c值的可变性都有了稳定的进步。总之，NGSP认证的方法被证实更为稳定，与NGSP认定的目标值更为接近。依照CAP的调查结果，2007年已有99%的实验室使用NGSP认证的方法报告HbA1c的结果，而在1995年这一比例为0%（图3）。更多的信息可登陆www.ngsp.org，寻找NGSP认证过程以及NGSP认证方法和实验室清单。
国际标准化工作
国际临床化学联合会（IFCC）在1995年启动了一项全球性的HbA1c的标准化行动。当NGSP在美国推动HbA1c标准化工作的同时，IFCC则建立了一个工作组以推动达到一个统一的国际HbA1c标准化的目的，同时其也制定了明确的糖化血红蛋白测试的参考方法提供给NGSP作为新的标准目标。为了确切测试血红蛋白（HbA1c）β链N-端残基的糖化，有两套参考方法被付诸实施。这两种方法首先都要将血液用盐水进行洗涤，然后将红细胞置于氯化钠溶液中37℃以下孵育4个小时，最后再用水将红细胞溶解。接下来要做的是将溶血后产物置于蛋白内切酶Glu-C中37℃孵育18个小时，使Hb裂解为多肽，最后用毛细管电泳或者电喷雾离子阱质谱法来测定Hbβ链N-端多肽的糖化与否。这些参考方法已在2001年获IFCC批准。虽然这些方法非常精确，但却是费时、技术难度高、步骤繁琐以及费用昂贵，因此并不适合常规临床实验室使用。
IFCC已经取得了重要的进展。她不仅开发出了HbA1c测试参考程序、准备了高纯度的HbA1c参考材料，同时也建立一个参考实验室网络，并与NGSP以及其他网络组织进行了对比。然而IFCC与NGSP的测试方法采用新的IFCC校准标准后显示IFCC的结果始终要低大约1.5%-2%。针对这一问题，对IFCC以及NGSP的相关性进行评估后制定了一个方程式来解决。这一方程式（详见www.ngsp.org）能够将IFCC的结果与DCCT以及UKPDS所得出的有着重要意义的临床HbA1c结果联系起来。虽然IFCC/NGSP之间的相关性非常好，但其绝对数并不相同，因而把这一校准标准引入临床实验室将有可能给病人和临床医生带来巨大的混乱。所以在这一项目上，IFCC工作组的立场是避免混乱，同时建议使用IFCC/NGSP主方程式将NGSP单位%换算为参考标准中的单位mmol HbA1c/mol Hb后再进行报告。
事实上，在应该采用哪个数据来报告这个问题上一直存在着很大的争议。ADA、欧洲糖尿病研究协会（EASD）、国际糖尿病联合会（IDF）和一些其他国家的成员组织目前提供的是与DCCT/UKPDS数据直接相关的病人保健指南。其结果是在2004年成立了ADA/EASD/IDF的Alc测试工作小组以协调HbA1c的报告形式。2007年10月，IFCC以及ADA/EASD/IDF工作组发表了一项联合声明，一致同意HbA1c的测试结果应该做到全球标准化，这其中也包括参考系统以及结果报告形式。该工作组声称IFCC新的HbA1c的参考系统是唯一有效的达成测试标准化的手段，并建议HbA1c的测试结果采用全球通用的IFCC单位（mmol HbA1c/mol Hb）并且使用IFCC/NGSP主方程式NGSP单位（%）。此外，一项“平均血浆葡萄糖浓度”的研究正在进行中。如果这一研究达到了其特定的标准，那么一项从HbA1c结果中衍生的HbA1c平均血糖指标（ADAG）也将被作为HbA1c的解释来报告。联合声明还声称所有临床指南中的胰岛素水平都应该使用IFCC单位以及转化的NGSP单位来表达，ADAG值也一样。
