免疫组化常见问题及对策
免疫组织化学是应用抗原和抗体结合的原理，检测细胞内多肽、蛋白质等大分子物质的分布。这种方法的特异性强、敏感度高、发展迅速、应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。做免疫组化可能遇到许多问题，大体归纳起来，主要有非特异性着色﹑着色部位不对﹑假阳性﹑无阳性﹑阳性弱五大类以及其他一些小问题。现在就以上几点分别说明。
1、非特异性着色
非特异性着色就是在理论着色区域外的着色，这种着色与背景是有区别性的。造成非特异性着色的原因主要有：
1) 标本原因，肝肾内源性生物素含量高，与 SABC 结合导致非特异性着色，皮肤，肺组织胶原含量高，由于胶原带负电荷，易吸附试剂导致非特异性着色。
2) 切片干涸导致的边缘效应。
3) 抗体浓度过高。
4) 组织在处理中存在出血区或坏死区。
5) 洗涤不充分。
6) 显色剂氧化，显色时间长。
解决方法 ：
1) 一抗应做浓度梯度，选择阳性强背景好，信躁比高的浓度，做为抗体实验浓度。二抗浓度和时间一般不变。
2) 稳定实验条件，严格按操作说明进行。
3) 在实验中应保持切片始终处于水平状态避免抗体流失，从而使切片使切片干涸。
4) 在实验中应将试剂覆盖面积大于切片面积
5) 洗涤要充分，在背景十分深时，可用 37 ℃ 预温的 PBS 浸泡
6) 显色剂的配制要防止氧化，尤其是显色剂的配制是使用的用的容器，最好是灭菌过的。显色时间应在显微镜下严格控制。
2、着色部位不对
着色部位不对有三种情况。
情况一 : 本是胞浆抗原，但实验显示结果却在胞核有着色。
原因及解决办法：
1) 修复时间过长，修复条件十分严苛，这时应降低反应强度
2) 组织在二甲苯中静置时间过长，这时应更换标本。
3) 抗体中含有抗核蛋白抗体，这种情况已不多见。
4) 标本原因，标本处理不慎会导致总在同一个地方出现着色。
情况二 : 本是胞核抗原但显示结果却在胞浆。
原因及解决办法：
1) 核抗原不易暴露，需用热修复或延长修复时间来充分暴露。
2) 蛋白质是在胞浆翻译的，再转运至其他部位，所以出现浆着色也属正常。
情况三 : 本是胞膜抗原但显示结果却是在胞浆和胞膜都有着色。
原因：蛋白质是在胞浆翻译的，再转运至其他部位，处于转运过程中的膜蛋白有可能显示在胞浆。
3、假阳性
如不加一抗也有阳性信号主要原因是二抗引起的交叉，球蛋白是一个超家族，哺乳动物种属来缘近的容易发生交叉反应。如：羊抗兔抗体可与兔标本中球蛋白反应，二抗羊抗小鼠也可与大鼠，小鼠中的球蛋白起反应，尤其在修复的情况下。
4、无阳性
原因：
1) 抗原稳定性问题，由于许多蛋白质半衰期短易被破坏。
2) 标本制作过程中烤片时间过高时间过长，标本制作不规范。
3) 实验中漏加试剂，实验操作不规范。
解决方法：
1) 在标本固定中应该严格操作，做到及时固定。
2) 在浸蜡时温度不要太高，时间不要过长。一般 2小时×2次。烤片温度一般在60℃左右2小时。
3) 实验中要严格按照实验步骤操作。在所做指标既有单抗又有多抗时，要将一抗和二抗严格对应。
5、阳性弱
原因及解决方法：
1) 一抗浓度过低，解决方法：提高一抗浓度
2) 孵育时间过短，解决方法：按说明书严格操作
3) 抗体流失，解决方法：补加抗体
4) 显色时间过短，解决方法：在显微镜下控制反应时间
5) 抗原修复方法不当，抗原修复有许多种方法，如：修复、消化，不消不修，寻找适合的方法是解决阳性弱的有效方法之一。
6、其他问题及注意事项
在实验中尤其在修复后切片容易脱片。切片脱片的原因是什么？
答：切片原因有以下几点。 1). 切片没有经过防脱片处理。
2). 在切片后没有及时烤片。
3). 修复时间过长。
