蛋白质免疫印迹(Western Blot )(三)
四、SDS-PAGE电泳
1. 清洗玻璃板
一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
2. 灌胶与上样
(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。(操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶。)
(2)按前面方法配10%分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时,可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水,液封后的胶凝的更快。(灌胶时开始可快一些,胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下,这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢,否则胶会被冲变型。)
(3)当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了。再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小,从而使加样孔的上样体积减小,所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
(5)用水冲洗一下浓缩胶,将其放入电泳槽中。(小玻璃板面向内,大玻璃板面向外。若只跑一块胶,那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。)
(6)测完蛋白含量后,计算含50 ng蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5 ml离心管中,加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。(上样总体积一般不超过15 μl,加样孔的最大限度可加20 μl样品。)上样前要将样品于沸水中煮5 min使蛋白变性。
(7) 加足够的电泳液后开始准备上样。(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。)用微量进样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次,以免交叉污染。
3. 电泳
电泳时间一般4~5 h,电压为40 V较好,也可用60 V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。
五、转膜
1. 转一张膜需准备6张7.0~8.3 cm的滤纸和1张7.3~8.6 cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套,因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用。(用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里,要使膜浮于水上,只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里,膜与水之间形成一层空气膜,这样会阻止膜吸水。
2. 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫,用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。)在垫子上垫三层滤纸(可三张纸先叠在一起在垫于垫子上),一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
4. 要先将玻璃板撬掉才可剥胶,撬的时候动作要轻,要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动,直到撬去玻板。(撬时一定要小心,玻板很易裂。)除去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作),要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上,用手调整使其与滤纸对齐,轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上,要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫,擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行,要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触,接触后会发生短路。(转移液含甲醇,操作时要戴手套,实验室要开门以使空气流通。)
5. 将夹子放入转移槽槽中,要使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面。电转移时会产热,在槽的一边放一块冰来降温。一般用60 V转移2 h或40 V转移3 h。
6. 转完后将膜用1×丽春红染液染5 min(于脱色摇床上摇)。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。
六、免疫反应
1 . 将膜用TBS从下向上浸湿后,移至含有封闭液的平皿中,室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
2. 将一抗用TBST稀释至适当浓度(在1.5 ml离心管中);撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上,四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整;将抗体溶液加到保鲜膜上;从封闭液中取出膜,用滤纸吸去残留液后,将膜蛋白面朝下放于抗体液面上,掀动膜四角以赶出残留气泡;室温下孵育1~2 h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗两次,每次10 min;再用TBS洗一次,10 min。
3. 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触,室温下孵育1~2 h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗两次,每次10 min;再用TBS洗一次,10 min,进行化学发光反应。
七、化学发光,显影,定影
1. 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合;1 min后,将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触;1 min后,将膜移至另一保鲜膜上,去尽残液,包好,放入X-光片夹中。
2. 在暗室中,将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中;在红灯下取出X-光片,用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1 cm);打开X-光片夹,把X-光片放在膜上,一旦放上,便不能移动,关上X-光片夹,开始计时;根据信号的强弱适当调整曝光时间,一般为1 min或5 min,也可选择不同时间多次压片,以达最佳效果;曝光完成后,打开X-光片夹,取出X-光片,迅速浸入显影液中显影,待出现明显条带后,即刻终止显影。显影时间一般为1~2 min(20~25℃),温度过低时(低于16℃)需适当延长显影时间;显影结束后,马上把X-光片浸入定影液中,定影时间一般为5~10 min,以胶片透明为止;用自来水冲去残留的定影液后,室温下晾干。
应注意的是:显影和定影需移动胶片时,尽量拿胶片一角,手指甲不要划伤胶片,否则会对结果产生影响。
八、凝胶图象分析
将胶片进行扫描或拍照,用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
注意事项 | 1. 一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。 2. 显色液必须新鲜配置使用,最后加入H2O2。 3. DAB有致癌的潜在可能,操作时要小心仔细。
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其他 | 一、免疫反应 1. 用0.01 M PBS洗膜,5 min ×3次。 2. 加入包被液,平稳摇动,室温2 h。 |