染色质免疫沉淀DNA分析
实验概要
染色质免疫共沉淀是一种强力的方法，来联系蛋白质或其修饰的定位与基因组的关系。染色质分离并用特异性抗体判断是否与特异性 DNA 序列相结合。染色质免疫沉淀法亦可用来检测目的位点在基因组中的时空分布（用芯片或 DNA 测序）。本操作规程详细阐述了交联染色质免疫沉淀 (X-ChIP) 实验的具体步骤。
实验步骤
1. 交联和细胞收集
1) 取 2 个 150 cm2培养皿的融合细胞（每皿细胞数约 1 X 107 - 5 X 107 个）。向培养基中滴加甲醛以使蛋白和 DNA 相交联，甲醛的终浓度为 0.75%（体积百分比），室温下轻轻摇动 10 分钟。
2) 加入甘氨酸至终浓度为 125 mM，轻轻振荡孵育 5 分钟。
3) 用 10 ml 冷 PBS 洗涤细胞 2 次。
4) 用 5 ml 冷 PBS 刮下细胞，转移至一个 50 ml 离心管中。
5) 用 3 ml PBS 洗涤培养皿，收集剩余细胞至 50 ml 离心管中。
6) 1000 g 离心 5 分钟。
7) 小心吸弃上清液，用 FA 裂解缓冲液重悬沉淀（每 1 X 107个细胞加 750 μl）。
2. 超声
1) 将裂解液超声处理以使DNA断裂成约 500-1000 bp 的片段。不同的细胞系需要不同的超声时间，因此需分别进行优化。
2) 超声处理后，4 °C，8000 g 离心 30 秒使细胞碎片沉淀。将上清液转移到新管中。此染色质溶液将用于步骤 4 的免疫沉淀 (IP)
3) 每个超声后的样本均取 50 μl，此样本为抽样样本，用于定量 DNA 浓度（见步骤 3），并作为 PCR 的对照样本。
3. DNA浓度测定
1) 抽样样本用来测定 DNA 浓度，为后续 IPs 反应提供数据。用 PCR 产物纯化试剂盒（加 70 μl 洗提缓冲液，转至步骤 3.2a）或酚：氯仿（加 350 μl 洗提缓冲液，转至步骤 3.2b）来纯化 DNA。
2) 加入 2 μl RNA 酶 A (0.5 mg/ml)。置于 65 °C 恒温振荡 4-5 小时（或过夜）以解交联。按照 PCR 产物纯化试剂盒说明书来纯化DNA。样本可冻存于 -20 °C 冰箱中。
3) DNA 浓度测定: 取 5 μl 纯化 DNA，加入装有 995 μl TE 的离心管中，200 倍稀释，测定 OD260。根据公式 DNA 浓度（μg/ml）= OD260 x 10,000，计算每毫升染色质溶液中 DNA 的浓度。
4. 免疫沉淀
1) 使用步骤 2.2 中得到的染色质溶液继续此操作。建议每个免疫沉淀反应 DNA 含量约为 25 μg 。每个样本用 RIPA 缓冲液 1:10 稀释。应设一个抗体对照和一个仅加磁珠的对照。
2) 除对照外，其余样本中均加入一抗。事先应通过预实验得到最佳的抗体加入量。一般来说，每 25 μg DNA 加入 1-10 μg 抗体。
3) 所有样本均加入 20 μl 的 A/G 蛋白磁珠（预吸附了单链鱼精 DNA 和牛血清白蛋白，见步骤 4.3a），进行免疫沉淀反应，4 °C 旋转过夜。
4) A/G 蛋白磁珠与单链鱼精 DNA 混合液的制备：如果使用 A 蛋白和 G 蛋白两种磁珠，应将其等体积混合，并用 RIPA 缓冲液洗涤 3 次。吸弃 RIPA 缓冲液，加入单链鱼精 DNA 至终浓度 75 ng/μl，同时加入牛血清白蛋白至终浓度 0.1 μg/μl。加入等体积 RIPA 缓冲液，常温旋转孵育 30 分钟。用 RIPA 缓冲液洗涤一次，然后加入等体积 RIPA 缓冲液。
5) 将 A/G 蛋白磁珠离心，2000g 1 分钟，弃上清。
6) 用 1 ml 洗涤缓冲液洗涤磁珠 3 次。2000g 离心 1 分钟。
7) 用末次洗涤缓冲液洗 1 次。2000g 离心 1 分钟。
5. 洗提和解交联
1) 洗提 DNA：向 A/G 蛋白磁珠中加入 120 μl 洗提缓冲液，30 °C 旋转 15 分钟。
2) 2000g 离心 1 分钟。将上清液转移至新管中。样本可于 -20 °C 保存。
3) 纯化 DNA 可用 PCR 纯化试剂盒（见步骤 3.2a）或酚:氯仿（加 280 μl 洗提缓冲液，然后参照步骤 3.2b）法进行。
4) DNA 可用实时 PCR 进行定量检测。可用实时 PCR 仪自带的软件进行引物和探针设计，或者使用在线设计工具进行设计。
