夹心ELISA实验方案
实验概要
夹心 ELISA 的一般程序。
实验原理
夹心 ELISA 测定两层抗体（即捕获抗体和检测抗体）间的抗原数。要测定的抗原必须包含至少两个能够结合到抗体的抗原位点，因为至少两个抗体在夹心中起作用。
单克隆或多克隆抗体均可在夹心 ELISA 系统中用作捕获抗体和检测抗体。单克隆抗体识别单一表位，可对抗原中微小差别进行精细检测和定量。多克隆抗体通常用作捕获抗体以沉降尽可能多的抗原。
夹心 ELISA 的优点是不必在分析前纯化样品，并且测定非常灵敏（灵敏度比直接或间接 ELISA 高 2 至 5 倍）。
实验步骤
1. 用捕获抗体包被
1) 用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液 (pH9.6) 中浓度为 1-10 μg/ml 的捕获抗体包被 PVC 微量滴定板的孔。
如果使用未纯化抗体（例如腹水液或抗血清），可能需要通过增加样品蛋白质的浓度（尝试用 10 μg/ml）补偿较低量的特异性抗体。 |
2) 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在 4℃下孵育过夜。
3) 弃去包被液，并洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入 200 μl PBS。在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去溶液或洗涤液。在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴。
2. 封闭和加样
1) 每孔添加 200μl 封闭缓冲液（5% 脱脂奶粉/PBS），封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。
2) 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育至少 1-2 小时，或如更方便的话，则在 4℃下孵育过夜。
3) 将 100 μl 适当稀释的样品添加到每个孔。要得到准确的定量结果，通常做法是比较未知样品与标准曲线的信号。每个酶标板都必须测定标准品（两重测定或三重测定）和空白样，以确保准确性。在 37℃下孵育 90 分钟。
为了进行定量，所用标准品浓度应涵盖抗体结合的大部分动态检测范围。可能需要优化浓度范围以确保获得合适的标准曲线。为了进行精确定量，通常样品和标准品采取两重测定或三重测定。 |
4) 弃去样品，并洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入 200 μl PBS。
3. 用检测抗体孵育，然后用二抗孵育。
1) 将 100 μl 稀释的检测抗体添加到每个孔。
确保检测抗体识别与包被的捕获抗体有所差别的靶蛋白表位。这可以防止对抗体结合的干扰，并且确保检测抗体的表位可用于结合。尽可能使用已测试的成对匹配抗体。 |
2) 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 2 小时。
3) 用 PBS 洗涤微量滴定板四次。
4) 添加 100 μl 偶联二抗，其在使用前便已在封闭缓冲液中稀释成最佳浓度（依照制造商说明书）。
5) 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 1-2 小时。
6) 用 PBS 洗涤微量滴定板四次。
4. 检测
虽然有许多不同类型的酶可用作检测，但是辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (ALP) 是 ELISA 测定中最广泛使用的两种酶。某些生物材料具有高水平内源酶活性（例如肺泡细胞中的高水平 ALP、红细胞中的高水平过氧化物酶），考虑到这一事实是非常重要的，这可能会导致非特异性信号。如有必要，用左旋咪唑（针对 ALP）或用 0.3% H2O2 的甲醇溶液（针对过氧化物酶）进行另外的阻断处理。
5. ALP 底物
对于大多数应用，pNPP（对硝基苯磷酸盐）是最常用的底物。在室温下孵育 15-30 分钟后，可在 405 nm 处测定硝基苯酚呈现的黄色。（该反应可通过添加等体积的 0.75 M NaOH 终止）。
6. HRP 显色液
HRP 的底物为过氧化氢。过氧化氢的裂解与氢供体的氧化偶联，反应期间氢供体的氧化使颜色发生变化。
7. TMB (3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)
将 TMB 溶液添加到每个孔，孵育 15-30 分钟，添加等体积的终止液 (2 M H2SO4)，然后在 450 nm 处读取光密度。
8. OPD (邻苯二胺二盐酸盐)
在 492 nm 下测定终产物。注意底物对光敏感，应将它存放在暗处。
9. ABTS (2,2’-联氮-双-[3-乙基-苯并噻唑啉-6 磺酸] 二铵盐)
终产物为绿色，可在 416 nm 处测定光密度。
注意：某些酶底物被认为是有害的（潜在致癌物），因此始终要小心处理并佩戴手套。
1) 使用多道移液器或多档移液器为每孔分配 100 μl（或 50 μl）底物溶液。
10. 数据分析：
由系列稀释液得到的数据绘制标准曲线，浓度标在 X 轴（对数标度）上，而吸光度标在 Y 轴（线性标度）上。通过内插法在此标准曲线上得出样品浓度。
