详细举例介绍PCR引物设计的流程
先几个比较好用的PCR引物数据库
Primerbank（HS and MM)
http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
OriGene
https://www.origene.com/category/gene-expression/qpcr-primer-pairs
qPrimerDB
https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/
RTPrimerDB
http://www.rtprimerdb.org
NCBI Probe
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe
引物设计流程
1. 获取序列
登陆NCBI, Gramene, EBI等核酸数据库，收索相关序列并根据需求下载目标格式文件。
2. 序列编辑与整理
可以通过DNAman, DNA star ,Geneious等软件将下载好的序列进行编辑整理。
3. 引物定位
推荐软件：Blastn/p，ClustalW。
4.引物设计
推荐软件：Primer Premier,还可以利用高级引物功能，进行引物数据库收索，巢式引物设计，引物编辑分析等其他功能。
5.获取序列
结合设计出的引物和序列编辑整理软件获取扩增后目标序列，并进行比对分析；并指导引物定位和序列编辑整理。
6.引物综合评价
推荐软件Primer Blast，Oligo等。
评价指标：Tm值，GC含量，长度，二级结构，结合位点特异性,可以通过软件对这些指标进行评定，特别是实时定量PCR原理实验，引物的扩增效率对检测准确性的影响非常大。
定量PCR引物的验证和具体评价方法
设计原则
产物长度在80-300bp之间
产物GC含量在50-60%之间
引物的GC含量在50-60%之间，熔解温度在55-65℃之间
应避免引物中有连续的G或C，但推荐在引物的末端含有G或C
应避免出现二级结构
验证方案
标准曲线法。
制作标准曲线,选择合适的标准品作为扩增模板，梯度稀释，扩增结束后以模板系列稀释倍数log值为X轴，以对应的Ct值为Y轴（反之亦可），制作标准曲线。
扩增效率（E）计算公式：E=10-1/斜率-1
即一般认为扩增效率应介于90——110%之间，与之相对应的斜率介于-3.58——-3.1之间。
在其它参数正常的前提下，即可判定定量PCR引物扩增效率良好。
通过数据库或者软件获得的引物序列，对引物的各种指标进行评定，可以对引物的扩增效率有一个前瞻性的认识，特别是定量PCR实验，引物的扩增效率对检测准确性的影响非常之大。
