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miRNA引物设计流程介绍

2020.6.09

MiRNA的命名原则可以大致归纳如下：

一个系统命名包含三部分内容，即物种，microRNA类别，序号。三者间用短线连接。物种一般用三个小写字母表示，如hsa,mmu和rno分别代表人，小鼠和大鼠。MicroRNA类别是指所命名的microRNA是pre-miRNA还是mature miRNA。pre-miRNA用mir表示，mature miRNA用miR表示。序号为一阿拉伯数字，代表microRNA发现的先后。一般而言，数字越小，发现越早。

位于基因组不同部位但产生同样的mature miRNA的pre-miRNA在序号后添加短线和阿拉伯数字以示区别，如hsa-mir-7-1, hsa-mir-7-2, hsa-mir-7-3。

有些pre-miRNA可以产生两个mature miRNA。对应pre-miRNA茎环结构5‘和3‘序列的mature miRNA分别加后缀-5p和-3p以示区分，如rno-miR-325-5p和rno-miR-325-3p。

如果从同一个pre-miRNA成熟的两个mature miRNA的相对表达量已知，表达量高者加后缀＊，如hsa-miR-17*比hsa-miR-17表达量高。

对于仅相差1－2个碱基的mature miRNA，加一个小写字母后缀以示区别，如hsa-miR-19a, hsa-miR-19b。

为了更好地将miRNA与siRNA及其他非编码小RNA或mRN***段区分开来,科学家们对miRNA的命名作了如下规定：

(1)miRNA简写成miR-No.,它的基因简写成mir-No. 如miR-21；

(2)高度同源的miRNA在No.其后加英文字母(小写,一般从a开始) 如miR-199a 和miR-199b；

(3)由不同染色体上的DNA序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的miRNA，则在后面加上阿拉伯数字以区分, 如miR-199a-1和miR-199a-2；

(4)如果一个前体的2个臂分别加产生miRNA，则根据克隆实验，在表达水平较低的miRNA 后面加“*” ，如miR-199amiR-199a*，或进行如下命名，miR-142-5p(也可命名为miR-142-s，表示从5' 端的臂加工而来)和miR-142-3p(也可命名为miR-142-as，表示从3?端的臂加工而来)；

(5)将物种缩写置于miRNA之前，如hsa-miR-195；

(6)确定命名规则之前发现的miRNA，如let-7，

（设计引物只看有无miR-阿拉伯数字后面的a,b，与其他的数字、字母关系不大）

microRNA的引物设计
以hsa-miR-145为例设计引物，其成熟体序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU
反向引物：每个反向引物的都带有一段固定的序列，可以形成一个茎环，
固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，
TGGTGTCGTGGAGTCG
在这个序列后加上八个碱基，这八个碱基是hsa-miR-145从后面数八个碱基的反向互补序列，就是GAAUCCCU的反向互补：AGGGATTC，最后得到的反向引物的序列为
5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AGGGATTC -3，
正向引物：每个正向引物也带有一段固定的序列，固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG
在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列，成熟体除掉后面六个碱基后序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGA，把U变成T即可，最后的序列为：
5，-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA -3，
URP：统一反向引物，也是一段固定的序列，TGGTGTCGTGGAGTCG
U6引物F-CTCGCTTCGGCAGCACA ，R-AACGCTTCACGAATTTGCGT
使用方法：
1逆转的引物：所有要做的miRNA反向引物的混合，每个10微升
2PCR的引物：50微升的体系，30微升的水，10微升的正向引物，10微升的URP

自学的miRNA引物设计：

一个发夹结构： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-（Detection of let-7a microRNA by real-time PCR in gastric Carcinoma） Tm值87.5℃

设计实例：

>hsa-let-7a MIMAT0000062

UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU

let-7aP RT : GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTA

let-7aPf: GCCGCTGAGGTAGTAGGTTGTA 66.5

let-7aPr: GTGCAGGGTCCGAGGT（通用的） 55.1 好像有二聚体哦

这个我自己截取的：

>hsa-miR-16 MIMAT0000069 UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG

茎环引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA

上游引物：TAGCAGCACGTAA (21nt，Tm值65.5℃，GC含量52.4%)

下游引物: GTGCAGGGTCCGAGGT（通用的）（16nt，Tm值55.1，GC含量68.8%）?

还有得CGCCGCCCAGTGTTCAGA这个没有二聚体（乳腺癌的那篇文章）这个应该是他写错的吧，应该是他的上游引物

flase priming

是指PCR过程中非模板序列引起的引物序列延伸，一般是由于引物的3'端与非模板序列结合，Taq酶沿该序列行进DNA聚合反应造成，危害：1.产生了非特异产物，多数情况下，由于缺乏对侧相应的假引发，产物只成线性增长，速度远小于PCR真引发产物的指数增长，不影响PCR，但是，一旦发生对侧假引发，假引发产物也呈指数增长，就造成非特异产物，这往往是PCR失败的原因

2.破坏了引物，假引发在引物的3'端添加了不可知的意外碱基，使引物的3'端不再和模板互补，结果是引物虽然和模板结合但不能引发正常PCR产物，其结果就是引物的大量破坏，同时竞争引物结合位点，致使PCR正常产物减少。

原因：引物的特异性不好（模板的同源序列，重复序列），退火温度偏低，模板在某些条件下形成高级结构（茎环，发夹，沟槽，），引物的高级结构（发夹）

Dimer 二聚体

>hsa-miR-126 MIMAT0000445 UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG

茎环引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCATT

上游引物：GGCTCGTACCGTGAGTAAT（这个能blast出来的最短序列，但是他自身有发夹结构和二聚体的形成，头疼）

下游通用引物：GTGCAGGGTCCGAGGT

1.逆转录的茎环引物：在一个茎环结构上添加与microRNA3‘端互补的6个碱基即可，但是也有文献说与目的miRNAme互补的碱基不能低于7个，纠结，还有关于这个茎环结构的选择，有什么讲究吗？比如说下面这两个茎环结构哪个好呢?1)GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 2)GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC

1.我们用的一般是6个碱基，基本都能扩出来，有时候参数根据情况也可能增到7-8个，只要不和forward primer 有重合的碱基，茎环好像一般有两种，我们用的是CAGAGCCA这种。
2.realtime PCR forward primer 一般取目标序列5‘的前14个碱基，有时可能会减到12个，前面再根据GC含量和Tm高低补6个到8个左右的游离碱基

	jh139-01	CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACGCGT
	jh139-02	GGGGTTATTGCTTAAGAA
mmu-miR-137		uuauugcuuaagaauacgcguag
mmu-miR-137	MIMAT0000149	UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG
mmu-miR-137*	MIMAT0016986	ACGGGUAUUCUUGGGUGGAUAAU
		acggguauucuuggguggauaau