免疫沉淀 (IP)
实验概要
免疫沉淀是一种纯化蛋白质的方法。将我们感兴趣的一种蛋白质的抗体与细胞提取液孵育，以使抗体和蛋白质在溶液中结合。然后用protein A/G 耦合的琼脂糖凝胶，从样品中将抗体/抗原复合物提取出来。这种物理方法可将所需蛋白质从样品中分离。然后样品可以通过SDS-PAGE 进行分离并做 Western blot 分析。
实验步骤
1. 裂解
1) 培养细胞的裂解
a. 将细胞培养皿放置冰上并用冰冷的 PBS 洗涤细胞。
b. 吸干 PBS 后，再加入冰冷的裂解液（1 ml 每 107 cells/100 mm2培养皿/150 cm2培养瓶，0.5 ml 每 5 x 106 cells/60 mm2培养皿或 75 cm2培养瓶）。
c. 用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，然后轻轻将细胞悬液转移到预冷的 EP 管中。
d. 4 °C 持续振荡 30 分钟；
e. 放入微型离心机 4 °C 离心；您可能要根据细胞的类型更改离心力和时间。推荐是 12000 rpm 20 分钟，但是这必须由最终用户决定（如白细胞需要轻度离心）。
f. 从离心机中轻轻地取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到预冷的新管（放在冰上）中，弃沉淀。
2) 组织裂解
a. 用干净器械解剖所要的组织，最好在冰上，并快速操作以防止蛋白酶降解。
b. 将组织放入圆底离心管中，浸入液氮中“速冻”。样本在 -80 °C 储存备用或放在冰上立即匀浆。
c. 对于约 5 mg 组织，向管中迅速加入约 300 μl 裂解液并用电动匀浆器匀浆。
d. 裂解液冲洗刀片两次，每次 300 μl，然后 4 °C 持续振荡 2 小时（将回旋振荡器放入冰箱）。裂解液的体积根据组织总量来决定。蛋白提取物不宜过于稀释，以避免蛋白质损失，并尽量减少样品体积以便凝胶上样。最小浓度为0.1 mg/ml；最佳浓度为1-5 mg/ml。
e. 微型离心机 4 °C 12000 rpm 离心 20 分钟。从离心机中轻轻地取出离心管放置在冰上。吸出上清液放入预冷的新管（放在冰上）中，弃沉淀。
2. 裂解物预清除
1) 1 ml 裂解物中加入 50μl 同种动物来源和型的无关抗体或正常血清作为免疫沉淀抗体（一些研究人员首选兔，参考 Harlow and Lane，243 页），在冰上孵育 1 小时。
2) 加入 100 μl 珠浆。
3) 4 °C 孵育 10-30 分钟并轻轻搅拌。
4) 微型离心机 14000 g 4 °C 离心 10 分钟。
5) 丢弃珠子并保留上清进行免疫沉淀。
为了提高收率，珠子可用裂解液洗涤 1 或 2 次以上，并将上清收集在一起。
3. 免疫沉淀
1) 在冰上预冷离心管中加入 10-50 μg 含推荐量抗体的细胞裂解物。具体数量将根据蛋白质的丰度和抗体与蛋白质的亲和力来选择。通常在预实验中，通过增加抗体的量沉淀固定数量的蛋白质。
2) 样品和抗体孵育的固定时间 4 °C 1-12 小时（过夜），最好轻轻振荡或旋转。孵育时间的长短取决于蛋白质的量和抗体的亲和特性。
3) 同时准备琼脂糖珠子。如果使用单克隆抗体，选择 protein G 偶联琼脂糖珠子。如果使用多克隆抗体，protein A 偶联琼脂糖珠通常是适合的（请参阅“选择蛋白珠”表 9.1.5 下文）。如果买来的珠子是粉末，100 mg 的珠子与 1 ml 0.1 M PBS 孵育，洗 1 小时后珠子膨胀起来，然后离心，去除上清。加入 1 ml 含 0.1% BSA（牛血清白蛋白）PBS，混合 1 小时，PBS 洗涤 2 次。去除上清并加入 400 μl 含蛋白酶抑制剂的缓冲液（可与裂解液相同）就可以使用了。它可以在 4 °C 储存几天；在含 0.02 % 叠氮钠的 PBS 里会保存更长时间（使用当天配的新鲜裂解液充分洗涤珠子）。您也可以购买事先膨胀好的珠子直接使用。
4) 最后，去除最后一次上清并加入 25-50 μl 2 X 上样缓冲液。95-100 °C 煮沸 5 分钟，以变性蛋白并将其与 protein- A /G 珠子分离，随后离心并保持上清含有蛋白。然后，您可以冻存样品或进行 SDS - PAGE 电泳。
