免疫沉淀（IP）常见问题分析与解决办法
免疫沉淀（IP）常见问题分析
问题 |
可能原因 |
解决办法 |
| 高背景 | 吸取了不溶于去污剂中的蛋白（沉淀） | 离心后立刻吸取上清，如果发生了重悬，则需要再次离心 |
| 洗涤不完全 | 在洗涤过程中将 试管盖好盖子，倒转混匀几次保证洗涤充分后再离心 | |
| 非特异蛋白结合到珠子上了 | 珠子没有被充分封闭。确定使用所有BSA(fraction V)是新鲜配制的，用1％BSA的PBS封闭新鲜准备的珠子1hr。进行IP前使用PBS洗涤3-4次 | |
| 所用 抗体纯度不够 | 使用亲和纯化的 抗体，有限预吸附过的抗体 | |
| 抗体用量过多导致非特异性结合 | 确认推荐的抗体用量，减少抗体用量 | |
| 细胞数过多/裂解物中蛋白含量过高导致洗脱液中含有大量非特异性蛋白 | 减少细胞/裂解物用量，推荐使用10-500ug细胞裂解物 | |
| 非特异性蛋白结合抗体 | 减少上样量。也可以在进行 IP前将裂解物和珠子预孵育从而达到预纯化裂解物的目的。也有人使用和抗体来源及Ig亚型相同的无关抗体对裂解物进行预纯化 | |
| 在免疫沉淀过程中蛋白降解了 | 保证标本裂解时使用新鲜配制的蛋白抑制剂 | |
| 抗体洗脱过多 | 靶蛋白中含有过多的洗脱抗体 | 降低抗体用量；在进行IP 前将抗体交联到珠子上；使用梯度甘氨酸缓冲洗脱液. |
| 洗脱液中检测不到靶蛋白 | 标本中无靶蛋白表达，或者表达量非常低 | 根据蛋白表达资料确定检测标本中有靶蛋白的表达。如果蛋白表达水平很低，可以考虑增加裂解物的用量，但这样会增加非特异性结合。因此建议在进行IP前先对裂解物进行预纯化 |
| 所有抗体量不足，难以捕获靶蛋白 | 根据推荐量使用抗体，并根据实验结果优化抗体的用量. | |
| 靶蛋白没有从珠子上洗脱下来 | 确定使用正确的洗脱液并保证洗脱液的强度和pH值是适用于靶蛋白的 | |
| 抗体没有和免疫吸附的珠子结合 | 根据抗体的亚型确定所用珠子是否合适（ 参照IP的方法部分） | |
| 所用裂解缓冲液不适合 | 根据说明书确定该抗体检测的是变性还是天然蛋白；然后保证所用裂解液是恰当的（ 参照IP的方法部分） |
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