磷酸化位点分析实验-磷酸肽的质谱分析
| 实验方法原理 | 用于确定磷酸肽中磷酸化位点的压谱方法有两种不同的基本原理。 第一种方法依赖于在质谱仪条件下，如在 ESI 质谱仪的碰撞室或离子源中，或MALDI-MS 的 PSD 过程中，磷酸酯键的化学稳定性。因此，磷酸肽可通过磷酸酯键断裂产生的诊断离子鉴定。 第二种方式依靠检测磷酸酯基团使肽段增加的质量数。通常，在蛋白质磷酸化研究中所研究的蛋白质序列是已知的，因此，从理论上可以通过对磷酸基团加合在丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上引起的 8011 的质量数差的分析而检测蛋白产生的磷酸肽。因此，得到磷酸化蛋白质的酶切肽质量启通常由 MALDI-MS 分析，如果质量测定值与预期值一致，就可鉴定混合物中的磷酸肽。这两种方法不能鉴定出肽内的磷酸化位点。磷酸化位点的确定要靠能够有效测序的串联质谱的产物离子扫描技术。但是，在肽序列中只有一个可能的磷酸化位点情况下，如果能确实证明此肽段为磷酸肽磷酸化残基也能有效定位。如果磷酸化氨基酸类型已确定，无须离子扫描即能鉴定磷酸化位点的机会也会大大提高。 |
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| 实验材料 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 下面讲的 MS 扫描方式，已经成功用于磷酸肽的分析。总之，在不能掺入32p或标记物已经衰变到检测限以下的情况下．产生磷酸盐特异离子（例如一个诊断离子）的方法是很有用的。如果希望的话这种扫描模式也能用于分析放射性标记的磷酸肽，因为由放射性同位素磷酸盐对磷酸肽贡献的质量非常小，可忽略不计。需要注意的是，虽然有人担心质谱仪会被 32p样品污染．但这种可能性可以避免，只要在质谱实验之前等侯足够数量的半衰期 (32p的半衰期为两周）。需耍标记的实验，例如2D-PP 作图，可以在放射性活度足够强的时候做。 1. 源内 CID 可用 ESI 源内 CID 产生的负离子形式的诊断离子， H2PO4- (97u),P03- (79u). P02- (63u), 来检测鉴定磷酸肽。源内 CID 与在线 HPLC 结合，既可鉴别磷酸肽的洗脱时间，得到其色谱标识，又能得到其分子质量。具体做法是，在 Q1 之前的两个 skimmer 上加高的锥孔（cone）电压，扫描低质荷比的诊断离子。然后将 cone 电压恢复正常值（不会诱导产生解离）扫描高质荷比的离子。仪器的第一个 skimmer 位置使用加热的毛细管的质谱仪也能做类似的实验。这个方法使用了交替扫描技术，即在高八极杆补偿电压下进行诊断离子的选择性离子监测 (selecetion monitoring, SIM), 之后进行两个全扫描。第一个全扫描使用与 SIM 实验相同的高补偿电压，产生去质子化的磷酸肽分子离子及去磷酸的磷酸肽分子离子。最后在正常八极杆补偿电压下进行第二次金扫描，产生一个参考图。与高八极杆补偿电压下的全扫描比较。在 LC 分离过程中这种二次质谱扫描系列连续地重复进行,这个实验提供了相同的信息，但是因为使用SIM, 而不是扫描来检测诊断离子，每一个扫描循环更快速，也可能更灵敏。高八级杆补偿电压下的第一次全扫描与低补偿电压下的全扫描相比较，在多个肽段被共洗脱时，可以提供线索找到磷酸肽离子，肽混合物被微毛细管柱分离时，经常会有肽段共洗脱。这一技术分析磷酸肽标准品通常可低至几个fmol 上柱量。但对平体内、体外的实际样品，灵敏度通常在 pmol 范围。因为负离子的 CID 谱通常不能产生足够用于序列分析的碎片离子，如果能用微毛细管柱分离，在线连接 ESI-MS 系统，以负离子形式检测磷酸肽，然后切换到正离子模式的 CID 分析．当然会非常方便。目前采用诊断离子扫描模式的质谱仪这样做在技术上还有困难，也许将来使用非扫描模式的质谱仪可以达到这一目的。在四极杆这样的扫描质谱仪上做这一实验的困难在于不能达到正、负离子模式转换所要求时间。 2. 中性丢失扫描 中性丢失扫描是在二级四极质谱仪上用 ESI 正离于模式分析的。 Q1 没有用来为 Q2 中的裂解选择离子，而是用来扫描。Q3 也用来扫描，但质量扫描范围与 Q1 不同，确切地说，两个四极杆以不同的质量范围扫描，它们之间的差值与丢失的中性分子质荷比一致。对于从 [M+2H]2+磷酸肽上丢失的中性磷酸盐，其质量差值为 m/z 49 。从机理上看，只有磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸会发生β-消除，产生 98 的中性丢失。此方法的应用并不如源内 CID 方法普遍，因为会出现假阳性，而且还必须知道丢失磷酸盐的离子带电荷的状态。此方法的优点是以正离子模式进行分析，可以在同一次实验中通过检测磷酸盐的中性丢失启动 CID. 得到数据依据的 CID 扫描。 3. 前体离子扫描 此方法是在 ESI 负离子模式下对 Q1 进行连续扫描。所有的离子都在 Q2 中裂解， 03 中仅能通过一种离子，对磷酸肽来说通常是丢失的 po3- 基团(m/z 79) 。因此，质谱结果仅显示会丢失 m/z79 的离子的谱峰。这大大简化了混合物的分析，在纳喷离子源直接进样过程中可以分析得很好。如磷酸肽的诊断离子扫描一节所述，此方法还是存在测序的问题，即负离子模式检测磷酸丢失后，立即切换为正离子模式测序。 4. 产物离子扫描 由上文所述的特定扫描法得到的信息通常还不足以鉴定磷酸肽中的磷酸化残基。实际上，如源内 CID, 中性丢失和母离子扫描，是用来将磷酸肽从非磷酸肽中区别出来，而不是提供序列信息。只有在肽序列已知，且三种含羟基氨基酸只有一种存在的情况下，以上三种方法才能成功鉴定磷酸化残基。此外，只有在肽序列中只含有一个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的情况下，这种预先设定对答案的简化才起作用。在另一种情况下也可以提供肽序列中磷酸化位点的答案，即序列已知，磷酸化的氨基酸分析表明在此磷酸蛋白中只含有三种羟基氨基酸的一种时，再次简化了答案。当这两种情况都不存在时卡通常需要产生CID谱，并予以解析以确定磷酸肽的共价结构。观察磷酸肽的低能 CID过程，其一般趋势是，磷酸丝氨酸上的磷酸比磷酸苏氨酸更易丢失，磷酸苏氨酸比磷酸酪氨酸更易丢失磷酸，较短的磷酸肽比较长的磷酸肽更易于丢失磷酸，大概是由于在相同碰撞能量下，短肽的化学键上分布了更多的能量。有趣的是，很少能观察到磷酸氨基酸的亚氨离子，磷酸氨基酸的 immonium 离子是由磷酸丢失后形成的脱羟基丙氨酸和脱羟基-2-丁酸的断裂形成的。然而，用离子阱质谱监测磷酸肽的 CID 谱了在肽碎片离子谱中观察到脱羟氨 -2-丁酸取代了苏氨酸的位置。 展开 |
| 注意事项 | 已经发展了许多不同的策略和方法用质谱确定磷酸肽中的磷酸化位点，其区别在于质谱与肽分离技术的接口方式，以及所用的质谱方法。如果一个磷酸肽有 1pmol 或更多的量，磷酸肽就能够从 2D-PP 谱中提取出来，并用数据依赖的自动化的微毛细管 LC-MS/MS 分析。此方法快速，可以初步估计一个 2D-PP 斑点中磷酸肽的相对量，通过对 2D-PP 谱图的配比，有可能定性、定量地了解细胞或组织在不同肽态下分离的磷酸化蛋白在特定位点的磷酸化过程对于样品量大大低于 1pmol 量的样品，磷酸肽信号通常被平板中提取的杂质所干扰而看不到，这种情况下建议用毛细管液相色谱或凝胶电泳分离肽段。 展开 |
