磷酸化位点分析实验-磷酸肽的分离——IMAC 分离/富集磷酸肽
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| 实验步骤 | 磷酸肽分析的常见困难是由磷酸化的低化学计量值导致的，样品中相同序列肽段的磷酸肽的含量要比非磷酸化肽段含量少得多，这种情况下即使 32p标记的 2D-PP 上的点，经全蛋白质水解及 HPLC 组分收集，已经确定磷酸肽存在，用质谱技术也难以鉴定磷酸肽。数据依赖的 MS/MS 方法不能鉴定样品中含量少的成分，因为 CID 优先选择丰度高的离子进行分析，为了解决这一问题常用 IMAC 选择性富集磷酸脱这一技术将 Fe3+ 或 Ga2+等金属离子整合到含有亚氨基二乙酸 (iminodiacetk acid) 或次氮基三醋酸 (nitrilotriacetic acid) 的色谱固定相上。磷酸肽与固定相有高亲和力，被选择性地吸附在上面。用磷酸盐或高 pH 溶液洗脱，洗脱组分即为富集的磷酸肽。虽然这一方法对磷酸肽有选择性，但其他肽，特别是那些富含酸性氨基酸链的肽段也容易被富集。IMAC 柱上洗脱下的组分可用不同的 MS 方式分析。本方法的优点是每一个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都能被富集，而且 IMAC柱洗脱下的样品可直接用于 RP-HPLC 分析。可以建立串联的 IMAC/RP 柱结构，将肽的富集和分离整合到一起。 展开 |
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