强迫游泳、悬尾、旷场实验相关-抗郁丸对CUMS抑郁症大鼠行..
强迫游泳、悬尾、旷场实验相关-抗郁丸对CUMS抑郁症大鼠行为学及机理的影响
摘要：目的 研究抗郁丸对慢性温和不可预见性应激（CUMS）抑郁症大鼠行为学及血清中甲状腺激素、细胞因子的影响，探讨抗郁丸治疗抑郁症的作用机理。
方法 采用慢性温和不可预见性应激结合孤养方法构建CUMS大鼠模型。60只雄性大鼠随机分为正常组（10只）和模型组（50只），模型组造模3周后，随机分为模型对照组、丙咪嗪组及抗郁丸低、中、高剂量组，每组10只，记录大鼠体重及糖水消耗量变化，并进行开场行为检测、强迫游泳实验及悬尾实验。给药8周后处死大鼠，腹主动脉取血，分离血清，测定大鼠血清中甲状腺激素及细胞因子含量。
结果 模型对照组大鼠体重增长减慢，糖水消耗量减少，行为运动得分降低，强迫游泳不动时间及悬尾不动时间延长（P＜0．05），血清中四碘甲状腺激素氨酸（T4）、促甲状腺激素（TSH）含量降低（P＜0．05），白介素1β（IL－1β）、肿瘤坏死因子（TNF－α）及IL－6含量升高（P＜0．05），与正常组相比差异有统计学意义。抗郁丸及丙咪嗪可加快模型大鼠的体重增长，增加糖水消耗量，增加行为学得分，缩短强迫游泳不动时间及悬尾不动时间（P＜0．05），并提高血清中T4及TSH含量（P＜0．05），不同程度降低IL－1β、TNF－α及IL－6水平（P＜0．05），与模型对照组相比差异有统计学意义。
结论 抗郁丸能改善CUMS大鼠抑郁症状，逆转抑郁症大鼠血清中甲状腺激素及细胞因子的含量，这可能是其发挥抗抑郁作用的重要机制之一。
关键词：慢性温和不可预见性应激；抑郁症；甲状腺激素；细胞因子
抑郁症是一种由于身体某些器官功能紊乱或长期失落心境而引起的慢性应激病理状态，其发病率高、发病年龄广泛，严重威胁人们的健康和生命，导致沉重的社会负担。资料显示，全球抑郁症发病率为4．2％，中国高达6．9％，并且以11．3％的增长率逐年增加。据预测到2020年抑郁症将上升为全球第二大疾病负担。因此，对抑郁症发病机制及治疗的探讨成为世界关注的重点。目前临床常用药物包括三环类、四环类、神经递质类抑制剂、单胺氧化酶抑制剂等，但由于副作用大、疗效不理想、依从性差制约了临床应用。而抑郁症是一种典型的生物、心理、社会等多因素作用导致的疾病，可引起人体多系统的病理反应，因此多层次、多靶点的中医治疗具有一定的潜力和优势。根据传统的疏肝解郁名方，我们开发出的抗郁丸以抗抑郁为主，兼有健脾理气、养血柔肝、清热除烦、养心安神之功效，本实验通过慢性温和不可预见性应激（chronicunpredictablemildstress，CUMS）结合孤养方式构建大鼠抑郁症模型，研究抗郁丸对抑郁症的功效，并以三碘甲状腺氨酸（triiodothyronine，T3）、四碘甲状腺氨酸（tetraiodothyronine，T4）、促甲状腺激素（thyroid-stimulatinghormone，TSH）以及白介素-1β（interleukin1β，IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactorα，TNF-α）为观测指标，初步探讨其作用机理。
1材料与方法
1．1 实验动物造模及分组
选用SPF级健康雄性SD大鼠60只，体重（200±10）g，由中山大学动物实验中心提供，许可证号为SCXK（粤）2011－0029。适应性饲养1周后，根据体重随机分为正常组（n＝10）和模型组（n＝50），正常组5只／笼饲养，实验中不受任何刺激，模型组单笼饲养，采用CUMS法，每天随机进行一种应激：禁食（24h）、禁水（24h）、夹尾（1min）、昼夜颠倒、潮湿垫料（垫料：水＝1∶1）、鼠笼倾斜（45°）、冰水游泳（4℃，5min）、合笼（5只／笼，24h），前后两天刺激不能相同，使大鼠不能预料刺激的发生种类，避免产生适应现象。造模3周后，将模型组大鼠根据体重随机分为模型对照组（双蒸水5ml／kg）、丙咪嗪组（15mg／kg）、抗郁丸低剂量组（144mg／kg）、中剂量组（288mg／kg）、高剂量组（576mg／kg），每组10只，各组每日灌胃一次，从第4周开始，连续给药8周，给药同时继续进行刺激。
1．2 实验试剂与仪器
抗郁丸，由无限极（中国）有限公司研发中心提供的复合药，0．6g／片，主要成分为当归、川芎、陈皮、香附、白芍。低、中、高剂量组大鼠的给药剂量分别按照相当于成人使用量的0．5倍、1倍、2倍计算，配置成相应浓度的混悬液（144、288、576mg／kg），4℃冰箱保存备用。丙咪嗪（广州市天骐生物科技有限公司），剂量15mg／kg，蔗糖（广州辉旺实验仪器有限公司），用大鼠日常饮用水配置成1％浓度溶液，现用现配。T3ELISA检测试剂盒、T4ELISA检测试剂盒、TSHELISA检测试剂盒、IL-1βELISA检测试剂盒、TNF-αELISA检测试剂盒、IL-6ELISA检测试剂盒（广州市一科生物科技有限公司）。开场实验敞箱（2500px×2500px×1000px）、强迫游泳玻璃缸（875px×875px×1250px）由上海欣软信息科技有限公司定制；电子分析天平（MettleToledo，Swiss），低温高速离心机（Eppendorf，Germany），Elx800酶联免疫检测仪（ELX800Bio-TecInstruments）。
1．3 各种行为学检测
1．3．1体重测量与糖水消耗量测量
于同等条件下每周进行1次体重及糖水消耗量测定。适应性饲养的1周对大鼠进行1％糖水偏好训练，每笼并排放置2个水瓶，两瓶均为糖水放置24h，随后一瓶糖水，一瓶纯水放置24h，再经过24h禁食禁水后，进行第一次糖水消耗量基线测定，造模开始后的每周在固定时间测定一次，测定时均为单笼。以1h糖水消耗量为评价标准。
1．3．2开场行为实验
于造模前、造模3周后、给药8周后用开场实验箱进行行为学观察。开场实验箱2500px×2500px×1000px，周壁为黑色，底面用白线划分为面积相等的25个小方格。将单只大鼠置于光洁开场实验箱中央，以动物穿越地面方块数为水平运动得分（四爪均进入的方格才计数），以直立次数为垂直运动得分（两前爪腾空或攀附周壁），以4min内大鼠行为学得分为评价指标。
1．3．3强迫游泳实验
在大鼠造模前、造模3周后、给药8周后在同等条件下进行，共3次。取一强迫游泳玻璃缸，加水深750px左右，水温稳定在室温，将大鼠轻放水中适应2min后连续观察4min，以4min内大鼠累计漂浮不动时间为评价指标。
1．3．4悬尾实验
在大鼠造模前、造模3周后、给药8周后在同等条件下进行，共3次。将SD大鼠尾端50px处固定于水平面上，使其呈倒挂状态，头部离台面约750px，四周以板隔离动物视线，适应2min后观察4min内的累计不动时间（不动指标为大鼠除呼吸外所有肢体均不动）。
1．4血清中甲状腺激素及细胞因子含量测定
大鼠于连续给药8周后，采用腹主动脉取血5ml，4℃10000r／min离心10min，分离血清，置于－80°冰箱保存待测，采用ELISA方法检测血清中T3、T4、TSH及IL-1β、TNF-α、IL-6的含量。
1．5统计学分析
采用SPSS17．0软件进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，两两分析采用LSD检验，P＜0．05为差异有统计学意义。
3讨论
20世纪60年代开始，人们针对抑郁症发病机制的中枢神经递质假说，试图通过药物诱发神经递质功能紊乱来建立相应的动物模型，主要包括有5-羟色胺酸（5-HTP）诱导甩头行为、利血平拮抗模型、高剂量阿扑吗啡拮抗模型等，但药物诱导的抑郁模型与人类抑郁症的发病机制相差甚远，且抑郁症状较单一。情志异常是抑郁症的主要病因，情志病因的实质是不良生活事件形成的心理应激，因此用慢性心理应激的方法制作抑郁症模型比较符合临床实际，本实验参考Willner等提出的慢性温和不可预见性应激程序并加以改进，结合孤养方式构建大鼠CUMS抑郁症模型，这与人类抑郁症中慢性、低水平的应激源导致抑郁症发生发展的机制更接近，糖水消耗是衡量动物对奖赏的敏感缺乏和快感消失的客观有效指标，抑郁症临床表现虽复杂多样，但其核心症状的实质是快感缺乏，糖水消耗量的减少，不仅较好地模拟人类抑郁症的核心症状，而且操作简便，重复性好，较敏感。研究结果显示，造模3周后，模型组大鼠糖水消耗量减少，体重增长缓慢，各种行为出现异常改变，与正常组比较差异有统计学意义，因此认为CUMS抑郁症模型造模成功，结果与文献报道基本一致。经过抗郁丸连续8周的治疗，抑郁症大鼠的糖水消耗量增加，体重增长加快，抑郁行为得以一定改善，说明抗郁丸对CUMS诱导的抑郁症大鼠具有一定的抗抑郁功效。甲状腺功能和抑郁症的关系一直受到人们的关注，但结论尚不明确。Whybrow等学者提出甲状腺功能与抑郁症有关，该学说指出甲状腺功能低下者，血中T3、T4含量下降，可降低抑郁症发生的阈值，更易发生抑郁。陈丹等在探讨甲状腺功能亢进与抑郁症关系的临床观察中发现，在甲亢初期，T3、T4水平较高时患者表现为高代谢症，抑郁症的发病率极低，在甲亢的治疗过程中，随着病情的好转，血清中T3、T4水平下降，抑郁症的发病率由6．8％增加至51％，进一步治疗后，甲状腺水平正常或偏低，甚至出现甲状腺减退时，抑郁症的发病率超过50％，表明甲状腺激素的动态下降参与抑郁症的形成及病程变化。而赵博等实验表明抑郁症大鼠血清T4、TSH呈升高趋势；陈宝忠等研究显示抑郁大鼠T4含量降低，T3、TSH无明显差异；佟海英等研究中，抑郁症大鼠T3含量升高，TSH含量降低；本实验中模型对照组大鼠血清中T4、TSH含量降低，抗郁丸可上调降低的T4、TSH水平。
甲状腺激素水平与抑郁症之间不一致的研究结论，折射出两者之间复杂的相关性，而甲状腺激素水平高低不一，除了与甲状腺激素自身的分泌调节受多种因素影响相关外，还可能与实验动物种属和性别、造模刺激方式和强度、造模时间、采血时间等因素有一定的关联性。“抑郁症的细胞因子假说”为探讨抑郁症的机制和治疗抑郁症提供了一个新的视角，越来越多证据表明细胞因子和抑郁症的发生之间存在密切联系。多项临床试验发现，相对于非抑郁症患者而言，抑郁症患者外周血液中炎症细胞因子呈高水平过表达状态，经治疗后抑郁症状缓解时细胞因子含量降低趋于正常水平。Wang等研究表明，注射细胞因子诱导剂的小鼠出现了体重下降、糖水消耗减少等抑郁样行为，抗抑郁药治疗后其症状明显好转。Thierno等对心肌梗死后的抑郁大鼠进行治疗后，大鼠的抑郁病态明显改善，同时血液中炎性细胞因子水平下降。本实验经检测模型组抑郁大鼠血清中IL-1β、TNF-α及IL-6含量升高，抗郁丸治疗后能有效降低IL-1β、TNF-α及IL-6的过表达，改善抑郁行为。细胞因子在抑郁症的发生中可能的机制为：通过神经内分泌功能介导、通过神经递质代谢介导、通过神经元细胞的功能介导。过度激活的细胞因子进入脑内相应区域，造成神经内分泌功能的紊乱、神经递质代谢障碍等一系列异常改变，在抑郁症的病理过程中发挥重要作用。
综上所述，抗郁丸能改善CUMS大鼠的抑郁症状，逆转甲状腺激素和细胞因子的异常水平，提示其可能是通过调节下丘脑－垂体－甲状腺轴分泌功能、调节炎症细胞因子表达从而发挥抗抑郁功效。
