强迫游泳和悬尾实验相关：越鞠丸醇提物对孕前应激诱...
强迫游泳和悬尾实验相关：越鞠丸醇提物对孕前应激诱导的产后抑郁小鼠模型的快速抗抑郁作用
越鞠丸醇提物对孕前应激诱导的产后抑郁小鼠模型的快速抗抑郁作用
摘要 目的：以孕前应激诱导建立产后抑郁（PPD）小鼠模型，观察越鞠丸醇提物（YJ）对该模型的快速抗抑郁作用。方法：将40只 BALB/C雌鼠随机分为２组，空白对照组不予任何刺激，孕前应激组给予慢性束缚刺激。3周后孕前应激组小鼠雌雄合笼交配怀孕，于分娩后３周检测模型组母鼠行为学，包括蔗糖偏好测试（SPT）、强迫游泳测试（FST）、悬尾测试（TST）及陌生环境摄食实验（NSFT）。造模成功后，将模型组随机分为4组：模型组、越鞠丸醇提物组、氯胺酮组、氟西汀组。越鞠丸醇提物及氯胺酮为单次给药，氟西汀为连续21ｄ给药。结果：产后3周，与空白对照组相比，孕 前 应 激 诱 导 的 产 后 抑 郁 组 模 型 母 鼠 在 糖 水 偏 好 测 试 中 的 蔗 糖 消耗 百 分 比 显 著 降 低 （P<0.001），在强迫游泳测试和悬尾测试中绝望状态不动时间显著增加（P<0.01，P<0.01），在陌生环境摄食实验中摄食潜伏时间明显增加而单位时间摄食量显著减少（P<0.01，P<0.01）。单次给予ＹＪ 和氯胺酮２4ｈ之后，模型组母鼠的糖水消耗百分比显著增加（P<0.01），强迫游泳和悬尾测试的绝望不动时间明显降低（P<0.01，P<0.01），陌生环境摄食测试中潜伏时间显著缩短且单位时间摄食量明显增加（P<0.01，P<0.01），而氟西汀组未显示相同作用。结论：氟西汀连续给药对于孕前应激诱导的PPD模型小鼠无明显治疗作用，提示该模型可能属于难治性抑郁模型；在此模型上，越鞠丸具有与西药氯胺酮一致的快速抗抑郁作用。
关键词 产后抑郁；孕前应激；越鞠丸；快速抗抑郁；氯胺酮
产后抑郁症 （ｐｏｓｔｐａｒｔｕｍ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ，PPD）是产褥期精神综合征中最常见的一种类型，以分娩后出现情绪低落，精神抑郁为主要症状，临床以沮丧、悲伤、哭泣、易烦躁、易激动，甚至出现幻觉，或有自杀及伤婴等一系列表现。PPD 严重危害产妇及婴儿身心健康，给家庭和社会也带来严重影响。PPD被认为是难治性抑郁。由于一线抗抑郁西药的副作用及局限性，不能有效地治疗 PPD，因此寻找快速安全有效且无明显副作用的中药变得迫切而实际。越鞠丸出自《丹溪心法》，功能行气解郁，是治疗抑郁症的经典方剂，临床上常用于抑郁症的治疗。本课题组前期研究发现越鞠丸对多个品系的小鼠模型具有与氯胺酮相似的快速抗抑郁作用，但该作用未在 PPD 动物模型上得到证实。PPD 的产生与多种因素相关，既往的应激性生活事件被认为是 PPD 发病的重要风险因素。本研究探索以孕前应激法构建 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠 PPD模型，以越鞠丸醇提物干预，观察越鞠丸对PPD模型小鼠的作用，以研究孕前应激对 PPD 致病的影响并验证越鞠丸对PPD的快速抗抑郁作用。
1材料与方法
１．１实验动物 清洁级健康成年雌性BALB/C小鼠４０只，体质量１８－２４ｇ，军事医学科学院提供，动物合格证号：２００７０００５８１３０３。适应性饲养 １ 周后用于实验。动物房室温２５ ℃、湿度为４５％，明暗交替时间为１２ｈ，动物可以自由饮食进水。
１．２越鞠丸醇提物（Ｙｕｅｊｕ ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔ，ＹＪ）制备实验用中药材购于南京中医药大学国医堂门诊，经本校药学院专家鉴定，为中国药典收载品种。取苍术、神曲、香附、栀子、川芎５种药材粉碎，过１００目筛，按等分重量混合后浸泡在９５％乙醇中（６倍体积）４８ｈ，期间不停搅拌。静置后取上清，同样过程重复两次，收集３次的上清液后过滤，减压浓缩至无乙醇。加入Ｔｗｅｅｎ－８０作为乳化剂（终浓度为0.5％），配制为实验所需浓度－２０ ℃保存备用。将浓缩后的ＹＪ 进行高效液相色谱（ＨＰＬＣ）分析，按照实验室之前确立的方法检验不同批次ＹＪ 的指纹图谱及稳定性，并对其主要成分定量分析以进行质控。
１．３实验试剂 盐酸氯胺酮（ｋｅｔａｍｉｎｅ，Ｋｅｔ）注射液为福建古田制药厂生产（批号：２０１４０３０１）。临用前用生理盐水配成３０ｍｇ／ｍｌ的药液。盐酸氟西汀（Ｆｌｕｏｘ－ｅｔｉｎｅ，Ｆｌｘ）为美国 Ｓｉｇｍａ公司 产品，根 据 Ｄｕｌａｗａ方法以生理盐水配成浓度１８ｍｇ／ｋｇ的药液。
１．４实验方法
１．４．１ 动物分组及模型的制备小鼠随机分为２组：空白对照组（ｎ＝８）和孕前应激组（ｎ＝３２），空白对照组不予任何应激，孕前应激组小鼠每天给予６ｈ束缚应激刺激（１１∶００－１７∶００）。３周后将孕前应激组以一雌一雄分笼交配饲养。大约４周后，母鼠分娩，被定义为 ＰＰＤ模型组（Ｍｏｄ）。
将模型组母鼠随机分为 Ｍｏｄ组（ｎ＝８），ＹＪ 组（ｎ＝８），Ｋｅｔ组（ｎ＝８），Ｆｌｘ组（ｎ＝８）。Ｆｌｘ组自产后第１天始每日腹腔注射 Ｆｌｘ注射液每１０ｇ体重０．１ｍｌ（相当于每克小鼠给予氟西汀０．０１８ｍｇ），持续２１ｄ。产后第２０天，根据薛文达等的研究结果，ＹＪ 组予ＹＪ 浓度１３．５ｇ／ｋｇ，以每１０ｇ体重０．１ ｍｌ灌 胃（相 当 于 每 克 小 鼠 给 予 越 鞠 丸 生 药０．０１３ ５ｇ），Ｋｅｔ组予 Ｋｅｔ注射液每１０ｇ体重０．１ｍｌ腹腔注射（相当于每克小鼠给予氯胺酮０．０３ｍｇ），２４ｈ后，检测各组母鼠的一系列行为学表现。
１．４．２ 小鼠的行为学测试指标
１．４．２．１ 蔗糖偏好试验 （ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｅｓｔ，ＳＰＴ）根据 Ｄｕｌａｗａ方法改进，在应激之前，对应激组和空白对照组予两瓶２％蔗糖溶液适应３ｄ。禁水禁食１８ｈ后，小鼠单笼饲养，每笼给予一瓶２％蔗糖溶液和一瓶自来水，观察 ２ｈ 蔗糖消耗量。蔗糖消耗计算公式为：蔗糖偏好百分比（％）＝［（蔗糖摄入量）/（蔗糖摄入量＋水的摄入量）］×100。
１．４．２．２强迫游泳实验（ｆｏｒｃｅｄ ｓｗｉｍ ｔｅｓｔ，ＦＳＴ）采用上海欣软信息科技有限公司的强迫游泳视频分析系统，将小鼠分别放入玻璃烧杯中，水温保持在２４－２６ ℃。让小鼠在其中游泳２ｍｉｎ后，立刻开始观察记录接下来的４ｍｉｎ内小鼠总的不动时间：即小鼠在水中停止挣扎，或呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动。
1.4.2.3悬尾实验（ｔａｉｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｔｅｓｔ，TST）采用上海欣软信息科技有限公司的悬尾测试视频分析系统，用胶带将小鼠悬挂于距台面３０ｃｍ 的支架边缘上，胶带ｔｔ粘贴位置在距小鼠尾尖1cm处。每只小鼠共悬挂5min，记录其在最后4min的不动时间。
1.4.2.4陌生环 境 摄 食 实 验 （ｎｏｖｅｌｔｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄｆｅｅｄｉｎｇ ｔｅｓｔ，ＮＳＦＴ）小鼠禁食 ２４ｈ 后，被放置在一个新的鼠笼内，底部铺上厚约１ｃｍ 的垫料，中心放置已经称重的粮食。放入后，检测小鼠开始吃食的潜伏时间。以吃食的潜伏期和消耗食物的重量为观测指标。如果小鼠５ｍｉｎ内没有吃食则定义为潜伏时间是５ｍｉｎ。小鼠单位时间摄食量（ｇ）＝５ｍｉｎ内消耗粮食重量（ｇ）／小鼠体质量（ｇ）。
１．５统 计 学 处 理 测 量 结 果 以 珔ｘ±ｓ表 示，应 用ＳＰＳＳ ２０．０ 统计分析软件对多组间数据进行单因素方差分析，ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔ选用 ＬＳＤ 方法，Ｐ＜０．０５为差异具有统计学意义。
3讨论
产后抑郁的病因复杂，与生物、社会、心理等因素密切相关。有学者发现PPD与多个风险因子有明显的关系，包括心理社会应激，不良生活事件，既往和家庭心境障碍史等多方面因素。既往的应激性生活事件被认为是 PPD 发病的重要风险因素，可能是因为持续的应激能增加易感性个体发生情感障碍的可能性。
本实验中，我们采用慢性孕前应激对适龄BALB/ｃ雌鼠造模，通过对产后 3周母鼠的蔗糖偏好试验、强迫游泳测试、悬尾测试及陌生环境摄食测试评估该PPD模型，发现该模型小鼠出现了快感缺失，兴趣下降，行为绝望以及伴有焦虑现象，这与PPD患者的临床症状极为相似，因此模型的建立是成功的。常规的PPD西医治疗主要包括心理治疗和抗抑郁药物治疗。选择性 ５－羟色胺再摄取抑制剂（Ｓｅ－ｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ Ｒｅｕｐｔａｋｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＳＳＲＩｓ）类是目前抗抑郁治疗中应用较多的一线抗抑郁药物。氟西汀是ＳＳＲＩｓ类代表药物，但其临床上存在起效缓慢、影响哺乳等不良反应，且有三分之一的病人对其无治疗反应。本实验中，连续２１ｄ的氟西汀给药对孕前应激诱导PPD模型小鼠的一系列抑郁样行为均无明显作用，提示该模型可能是一种难治性抑郁模型。这与目前研究认为PPD属于难治性抑郁的观点相一致。目前越来越多的学者致力于寻求能够治疗难治性抑郁的快速起效抗抑郁药物。
ＮＭＤＡＲ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ａｓｐａｒｔａｔｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）的拮抗剂氯胺酮目前被公认为是可用于治疗难治性抑郁、具有快速抗抑郁作用的药物。在临床研究及动物实验上，单次亚麻醉剂量的氯胺酮即可发挥快速持久的抗抑郁的作用。但是，由于氯胺酮具有的神经毒性和成瘾性等副作用，使其不能用于临床。我们可以氯胺酮为阳性参照，寻找具有与其一致的快速抗抑郁作用且没有其副作用的理想药物。近代中医认为产后抑郁症可归属于中医“郁病”范畴。产后抑郁病因复杂，几种病因又相兼为病，虚实夹杂，以郁为主。同时现代女性由于受家庭、生活等方面的压 力，郁 证 尤 多，出 现 “六 郁 并 集、诸 郁 并见”的病因病机。这与朱丹溪对于郁证的认识相同。丹溪指出：“气血冲和，万病不生，一有怫郁，诸病生焉”并创立了越鞠丸。《丹溪心法》云：“越鞠丸，解诸郁”。该方由苍术、川芎、香附、神曲、山桅组成，专为郁病而设，重在理气解郁，兼顾六郁。
古往今来越鞠丸作为治疗抑郁症的经典方剂，许多学者对其进行了研究。于雷统计了近３０年的越鞠丸治疗抑郁症的临床案例，发现其总有效率达９３．６５％，且副作用很低。尉小慧对越鞠丸抗抑郁活性进行研究，发现越鞠丸抗抑郁样作用是全方配伍综合作用的效果。本课题组前期发现以越鞠丸单次给药，在ＩＣＲ 和昆明小鼠上具有与氯胺酮相似的快速抗抑郁功效。本研究发现单次给予ＹＪ２４ｈ后能够显著改善孕前应激PPD小鼠模型的行为 学 指 标 。与ＰＰＤ模 型 组 相 比 ，ＹＪ组 显 著 增 加 模型母鼠的糖水偏爱百分比，降低模型母鼠在强迫游泳测试和悬尾测试中的绝望不动时间，缩短模型母鼠陌生环境摄食测试中的潜伏时间和增加其单位时间内摄食量，差异均有统计学意义。本研究发现在孕前应激PPD小鼠模型上，ＹＪ 具有与氯胺酮一致的快速抗抑郁作用。
总之，孕前应激诱导的 PPD小鼠模型是一种具有实验研究价值的PPD动物模型。常规抗抑郁药物氟西汀的慢性给药对该模型无明显治疗作用，提示该模型可能是一种难治性抑郁模型。而ＹＪ对PPD小鼠模型具有与氯胺酮相似的快速抗抑郁作用，提示越鞠丸可用于治疗难治性抑郁。本研究为快速治疗PPD的中药新药研发提供了依据，可以更好地指导产后抑郁症的治疗。
