多重端粒荧光原位杂交实验（三）
三、端粒克隆DNA的抽提
1.准备含特定抗生素50μg/mL氨苄青霉素、35μg/mL卡那霉素或12.5μg/mL氯霉素）的LB平板。
2.从-70℃取出甘油保存管，放在干冰上。
3.取甘油保存的菌种在LB平板划线后，37℃细菌培养箱培养过夜。
4.加100mL 2×YT培养基到500mL离心管中，按步骤1所示浓度加抗生素。
5.从平板上挑选单克隆接种到2×YT培养基，37℃摇床中培养过夜。
6.取700μL细菌培养物加300μL100%甘油混合均匀，分装在两个Eppendorf管中，标记好，-70℃条件下保存。
7.剩余的细菌培养物350g离心15min。
8.弃上清，将离心管倒扣在纸上沥干。
9.用30mL冷的细胞重悬液悬起沉淀，剧烈混匀和抽吸几次，使得小细胞团块彻底悬起10.加30mL细胞裂解液，上下轻轻颠倒一次。
11.室温放置5min(不要延长时间）。
12.立即加30mL冷的中和液，上下轻轻颠倒混匀。
13.冰上放置15min，每5min上下颠倒几次。
14.4℃下4000g•离心40min。
15.标记好一个新的250mL离心管，上面放一个塑料漏斗。
16.剪一个圆形的杂交网筛，中间剪开一个裂缝，装到漏斗上。
17.小心将离心的上清倒在网筛上，液体经过网筛和漏斗收集到250mL离心管里，注意不要有絮状物穿过网筛。
18.移去漏斗、网筛，用水、乙醇清洗以备下次使用。
19.加0.7倍体积的无水异丙醇沉淀DNA。
20.混合均匀，4000g离心10min。
21.弃上清，加入25mL70%乙醇。
22.振荡混匀，4000g离心10min。
23.弃上清，将离心管倒扣在纸上以去掉多余液体。
24.用1mL TE(pH8.0)重悬DNA沉淀。
25．取5μL抽提的DNA在0.9%的凝胶上电泳检测，用Xmnd III DNA作
为参考标准，完整的黏粒大小应该在大分子质量的位置。
26.测量抽提的DNA浓度（如使用荧光光度计)。
27.在-20℃储存抽提的DNA。
四、用缺口平移法间接标记端粒克隆DNA
1.将Eppendorf管放在冰上，然后加入1.0μg待标记DNA、1.2μL生物素-16-dUTP(如果标记短臂探针）或地高辛-11-dUTP(如标记长臂探针）等，加蒸馏水至总体积50μL。
2.轻轻振荡，稍离心以去气泡。
3.在15℃水浴中反应90min。
4.将反应体系放在冰上暂停反应。
5.取5μL在2%的琼脂糖凝胶上检测片段大小，用Phi×174作为DNA大小的参考标准。
6.最适于杂交的片段大小为50〜500bp条带。如果片段大于500bp，则补加1.0μL DNase I，15℃孵育30min
7.当探针大小合适时，用装有交联葡聚糖G50的SELECT-B离心柱过柱去掉未结合的核苷酸。
8.加25μL鲑鱼精DNA(若标记的探针超过1哗，则按比例增加鲑鱼精DNA。
9.加蒸馏水调整探针浓度为10ng/μL(应扣除已用于检测的探针量）。
10.记录10ng/μL探针混合物的体积。
11.每微升探针混合物加入适量的人Cot-1DNA[加入量依据探针和原始插入的片段大小而定。
12.计算好含120ng探针的人Cot-1DNA/探针混合物的体积，按体积取出移到新的Eppendorf管中。
13.在真空离心机中离心干燥Cot-1DNA/探针混合物（注意不要过于干燥)。
14.为了获得某染色体长短臂端粒特异性探针杂交液混合物，将Cot-1DNA/长臂或短臂探针混合物分别重悬在38μL杂交液中，两者合并成76μL杂交液。
15.若制备单独检测长臂或短臂端粒的探针，则将Cot-1DNA/探针混合物直接重悬在76uL杂交液中。
16．混匀后在-20℃条件下储存。
五、间接标记探针的杂交和杂交后处理
（1）杂交
1.打开加热板，调整温度到75℃并预热。
2.取18斗探针杂交液到Eppendorf管，并预热到37℃(水浴锅或加热
板)。
3.按照3.2.1中所示方法调整细胞悬液至最佳浓度。
4.将高质量显微载玻片浸泡在无水甲醇中2min。
5.用干净的软纸擦干片子。
6.将10〜20；×L调整好浓度的细胞悬液滴加到载玻片的中央。
7.将标本放置干燥，用相差显微镜的1〇倍物镜检查标本的质量。
8.在磨砂处标记实验内容，用钻石笔在载玻片背面划定样品区域。
9.准备一个染色缸装2×SSC，三个染色缸依次装70%、85%和100%的乙醇。
10.将制备好的片子（用固定的细胞悬液点样）用2×SSC洗2min，然后依次在70%、85%和100%的乙醇中各脱水2min。
11.片子空气干燥后，有样品一面朝上放在37℃加热板上12.轻轻上下抽吸混匀预热的杂交液，小心不要产生气泡。
13.吸取杂交液加到钻石笔划定区域的中央。
14.小心地将一个22mm×22mm盖玻片盖到杂交液，用钝头镊子轻轻按压排掉气泡。
15.小心地将片子（盖玻片一面朝上）放在75℃加热板上。
16.变性、1〜3min，变性时间取决于细胞悬液的老化程度
17.变性后立即转移到预热的避光塑料玻片盒中，37℃水浴中杂交过夜（水浴锅不盖盖子）。
