多重端粒荧光原位杂交实验（四）
（2）杂交后洗脱、抗体检测和复染
1.准备封闭液和抗体溶液1〜3。
2.振荡抗体溶液，在微型离心机中以最大转速离心10min。避光放置，如有必要可在室温中预温。
3.加洗脱液I到干净的染色缸中，水浴中预温到72℃后调整pH至7.0。
4．加洗脱液II到干净的染色缸中，室温（20〜25℃)放置。
5.同时将用水湿润的吸水纸放在一个空的避光塑料玻片盒（如空的玻片盒）的底部。
6.用剪刀为每个标本准备4张大小约为22mm×64mm的封口膜。
7.从避光塑料盒中取出标本，在纸上快速去掉盖玻片。
8.立即将片子放在洗脱液I中2min，用镊子夹住片子，轻轻的上下振荡。
9.转移到洗脱液n中30s。
10.夹住片子的长边，在纸上沥去过量液体10〜20s，注意不要使片子表面过于干燥。
11.将片子架到预先准备好的避光塑料玻片盒子中（如玻片两端搭在玻璃棒上或盒子底部平台上），取300μL封闭液加到片子上，用封口膜覆盖，避免产生气泡。
12.盖上玻片盒盖子，37℃温箱中孵育40〜50min。
13.37℃预热1.5LST缓冲液。•
14.孵育完成后去掉封口膜，将片子放在标本架上浸泡在预热的ST缓冲液中。
15.放在摇床平台上振荡3min，将倒置的避光容器放在上面保持暗环境。
16.按步骤10所示方法沥去标本上的过量液体。
17.将片子放到避光塑料玻片盒中架子上，取80μL抗体溶液1加到杂交区域。
18.用封口膜覆盖，避免产生气泡
19.盖上盖子，37℃温箱中孵育10min。
20.去掉封口膜，将片子放在标本架上浸泡在预热的ST缓冲液。
21.放在摇床平台上避光振荡3min。•
22.倒掉原来的ST缓冲液，更换新的预热ST缓冲液。
23.重复2次步骤21和22。
24.洗完3次后，按步骤10所示方法沥去过量液体。
25.将片子放到塑料避光容器中架子上，取5OμL抗体溶液2加到杂交区域。
26.用封口膜覆盖，避免产生气泡。
27.盖上盖子，37℃温箱中孵育10min。
28.去掉封口膜，在热的新ST缓冲液中洗3次，每次3min。
29.将片子按步骤10所示沥去过量液体。
30.将片子放到塑料避光容器中架子上，取80μL抗体溶液3加到杂交区域。
31.盖上盖子，37℃温箱中孵育10min。
32.去掉封口膜，在热的新ST缓冲液洗3次，每次3min。
33.在最后ST缓冲液洗脱过程中，加大约25μLDAPI复染液到放在纸上的22mm×22mm盖玻片上。
34.将片子按步骤10所示沥去过量液体。
35.轻轻地将片子的杂交区域倒扣到加有DAPI复染液的盖玻片上。
36.将吸水纸盖在标本上方，轻轻按压以除去过量的复染液。
37.检查复染的区域，用钝头镊子轻轻按压排掉气泡。
38.将指甲油涂在盖玻片周围来封片。
39.按二、（5）中所示方法避光放置至干燥后用荧光显微镜观察。
收起
注意事项
1.要制备高质量的染色体标本，最好使用肝素锂抗凝管收集外周血样品，样品应该室温运输并尽块进行培养。固定的细胞悬液质量随着储存时间的增加会明显下降。
2.封闭液可以大量制备，过滤后分装，可在4℃储存至6个月。
3.1mL抗体溶液4℃避光可储存1个月。
4.为避免污染，细胞培养基应使用细胞培养专用的水浴锅。
5.秋水仙胺阻止纺锤体形成，使细胞染色体阻滞在细胞分裂中期。秋水仙胺处理细胞的时间影响染色体的形态。如果处理时间太短，染色体可能会比较长，造成分裂指数较低；如果处理时间过长，染色体会太短而不适于分析。
6.低渗处理时间不够时，染色体无法从细胞中释放。处理时间过长，会造成大量细胞提前破裂。
7.尽管ChromoprobeMultiprobe®-T试剂盒提供的探针和试剂已经由Cytocell公司质检过，还是建议先使用高质量的正常对照染色体悬液进行预实验优化试剂盒杂交条件，然后再进行非常重要的待测样品的杂交。
8.尽管理想的分裂指数应>5%，但是有时会存在一些问题无法达到这个指标，例如，样品的制备时间长短或者来源（如白血病样品的有丝分裂就常常不够)。在这种情况下，应该确保在标本中央区约有5个中期分裂相。当有些样品的分裂指数非常低且样品又少的情况下，应该选择使用多色FISH技术，如MTEL来分析样品。
9.如果仅仅是少数方形块上的中期染色体不够，可以在原来上样的位置再点样。
10.可以将标本加热块翻转使得最上面是平面作为37℃加热板。但75℃电热恒温板必须是实心的，表面温度均匀。
11.最好是用一只手的食指和拇指拿住磨砂位置举起片子/Multiprobe装置，然后用另一只手的食指和拇指拿住（勿挤压装置）片子/Multiprobe装置，并翻转，可以用手掌或者用托盘托住保持水平进行转移。
12.正确的变性是很重要的。如果染色体变性时间太长，染色体会发胀并有可能沿着染色体臂留下探针信号（图2C)。相反，变性时间不够，虽然能保持染色体形态，但是如果能杂交上则杂交效率很低。总之，-20℃储存越久的细胞悬液，染色体变性时间应越长。例如，标本制备与杂交在同一天，那么变性的时间仅需要45s，然而一个样品放置超过一年，变性时间大于3min。制备时间为1〜3月的样品75℃平均变性时间是1min、15s。
13.—些显微镜的载物台使观察片子末端比较困难，如果遇到这种情况，可以采用180°旋转片子的方式使末端容易观测。
14.在记录结果以前，应该先熟悉使用的端粒克隆特点以避免发生错误的解释。某些克隆用于多态性检测是很正常的，这些克隆只和对应的同源端粒杂交，但是如果存在多态性，这些克隆仅有部分杂交上或者根本就没和同源的染色体杂交上。另外，有些克隆有交叉杂交的特点，这些克隆除了与同源的端粒杂交外，还和其他端粒杂交。举例说明，如图2中显示正常的3p3q杂交模式、2q探针多态性、12p的交叉杂交以及的一种具临床意义的不平衡端粒重排。表2列出了已知的第一代和第二代端粒克隆的多态性和交叉杂交模式。
15.当必须重复实验时，应该确定使用整个新的Multiprobe®玻片和装置是否合理。其他可选择的方式包括：①重新购买已经标记好的单个端粒探针（Cytocell公司或AppligeneOncor或Vysis);②获得一套甘油保存的端粒克隆，自己制备DNA和杂交用探针。后一种方式是比较经济的，一旦扩增克隆就可以批量标记和储存探针，合适的探针可以在-20℃至少储存2年。表1列出第一代和第二代端粒克隆有哪些，这些克隆的甘油保存株或穿刺培养物可以从何处获得;同时标记出ChromoprobeMultiprobe®-T试剂盒使用的端粒克隆。
16．—些与众不同的的结果可能反映真的亚端粒重排或者端粒多态性，但是此时更应该避免错误解释的发生。表2列举了使用第一代和第二代端粒特异性克隆探针有关的多态性和交叉杂交模式。图2是FISH实验实例
17.如果使用Cytocell公司ChromoprobeMultiprobe®-T试剂盒或其他市售试剂盒（如Vysis公司的TotelVys10nMulticolorFISHProbePanel试剂盒）就没必要制备端粒克隆DNA。但是可以获得和保存一套端粒克隆，以备少量重复实验所需。表1列出第一代和第二代端粒克隆有哪些，这些克隆的甘油保存株或穿刺培养物可以从何处获得，表1中的清单也包括ChromoprobeMultiprobe®-T试剂盒使用的端粒克隆。
18.如果没有干冰，甘油保存株可以放在冰上较短的时间，但是反复这样操作会降低甘油保存株的活性。
19.如果沉淀没能很快悬起，可以在4℃条件下放置过夜。
20.如果使用Cytocell公司ChromoprobeMultiprobe®-T系列试剂盒或其他市售试剂盒，不需进行此部分的操作
21.因为间接标记的探针可以保存2年左右，所以可以增加标记的DNA量和标记反应体积。，
22.批号不同的DNA酶可能其实际浓度也有差异，不同的模板使用的DNase用量也不同。最好在使用每一批新DNA酶时，对模板所用的酶量和反应时间进行优化，以备将来应用相同的条件标记同种模板探针。
23.每一批次探针的制备都应该优化Cot-1的使用量。Cot-1的用量应根据探针中Alu序列的含量。对端粒克隆而言，插入片段为30〜40kb的标记黏粒，Cot-1的用量一般是625ng/juL探针混合物；插入片段为小于100kb左右的PAC和小的BAC探针，Cot-1的用量一般是1哗/斗探针混合物；大的BAC探针，可加到3μL探针混合物。注意例外的是19号染色体的探针克隆，如F20643和20283需要加入10μL探针混合物。
24.如果没有电热恒温板，染色体可以在10%甲酰胺/0.1mol/L EDTA/2×SSC中70℃变性5min后，在4℃下用2×SSC洗3次，然后用系列乙醇脱水。探针混合物在加入到标本上之前进行单独变性，95℃、5min。
25.应该根据单色或双色检测的需要正确配制抗体溶液，抗体浓度是非常重要的。如果抗体的浓度太低，就可能没有杂交信号或杂交效率很低。相反，浓度太髙，可能会出现斑点样的背景，无法分辨是同源信号还是背景（图2D)。由于不同批次的抗体可能存在差异，所以在测试正式样品前，最好是先用可靠的对照探针与高质量的染色体悬液进行杂交，优化抗体稀释的浓度
