酶联免疫吸附试验及其应用（四）
表1：ELISA操作步骤
| 方法 步骤 | 间接法（测抗体） | 双抗体夹心法 | （测抗原） 竞争法 | （测抗原） 抑制性测定法 |
| 1 | 包被抗原：用包被缓冲液稀释抗原至最适浓度（5～20μg/ml）各0.3ml加于微反应板每个凹孔中,4℃过夜或37℃水浴2～3小时,贮存冰箱 | 包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10μg /ml），每凹孔加0.3ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱 | 包被特异性抗体： 同左 | 包被抗原： 同左 |
| 2 | 洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟 | 同左 | 同左 | 同左 |
| 3 | 加被检标本：每凹孔加入用含有0.05%吐温-20的稀释缓冲液稀释的被检血清各0.2ml，37℃，作用1～2小时 | 每凹孔加入0.2ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37℃作用1～2小时。 | 分2组,a组加酶标记抗原和被检抗原混合液0.2ml，另一组只加酶标记抗原液0.2ml，37℃作用1～2小时。（混合液可作成不同稀释度） | a组加参考抗体和被检抗原混合液0.2ml，另一组加参考抗体与等量稀释剂0.2ml，37℃作用1～2小时。 |
| 4 | 洗涤：重复2 | 同左 | 洗涤：同左 | 洗涤 |
| 5 | 加入酶结合物：每凹孔加入稀释缓冲液稀释的酶结合物0.2ml 37℃作用1～2小时 | 加入0.2ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37℃作用1～2小时或由预试实验确定作用时间。 | － | 各加入0.2ml抗参考抗体的酶结合物37℃作用1～2小时 |
| 方法 步骤 | 间接法（测抗体） | 双抗体夹心法 （测抗原） | 竞争法（测抗原） | 抑制性测定法 |
| 6 | 洗涤：重复2 | 同左 | 洗涤 | |
| 7 | 加入0.2ml底物溶液于每个凹孔,(O.P.D或O.T)，室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4ml底物加0.1ml终止剂）。 | 同左 | 同左 | 同左 |
| 8 | 加终止剂：每凹孔加2M H2SO4或2M柠檬酸0.05ml。 | 同左 | 同左 | 同左 |
| 9 | 观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（O.P.D用492nm）O.D值。 | 同左 | 用酶标比色计测定a、b两组O.D值，并求出a、b、O.D值的差数 | 同左 |
五、ELISA的应用
ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。酶免疫试验（EIA）结合光学显微镜或电子显微镜可进行抗原定位与结构的研究，用酶标记抗原或抗体结合免疫扩散及免疫电泳可提高试验的敏感性。在实际应用方面可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。因此，它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行病学及传染病学等方面密切相关。
检查抗原和半抗原方面：在内分泌方面已经用于检测雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等，其敏感性与RIA相当，在血液学方面可用于检查凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（Hapto
Globin）等，在肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA），对前者的敏感性已达到与放射免疫试验相当的水平，但对CEA检查的敏感性较低，目前尚不能用于常规诊断,在传染病的诊断方面正在日益扩大，其中最满意的是用于检查乙型肝炎表面抗原。国内外已有ELISA检测的商品供应。尚有用于检查霍乱弧菌、大肠肝菌、绿脓杆菌和破伤风梭菌毒素；脑膜炎球菌及淋球菌抗原；检查免疫抑制病人中常见的白色念殊菌抗原，检查病人或病兽的粪便中的轮状病毒，自病人标本中检查甲肝病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、流感、呼吸道融合及巨细胞病毒等。还可用于植物组织浆液中检查植物病毒。此外尚试用于测钩体抗原及血吸虫病的循环抗原等。在免疫化学方面可用于检测白蛋白，免疫球蛋白的各种组份，也可用于检测补体成份，如：ciq，还能用于检测蛇毒。
检查抗体方面：用ELISA间接法检查抗体，已获得对多种传染病和寄生虫病的血清学诊断，亦开始广泛用于现场流行病学调查。在寄生虫病方面，它用于对疟原虫、阿米巴、利日曼原虫、锥虫、血吸虫、囊虫、弓浆虫、肺吸虫、肝吸虫、血丝虫、旋毛虫病等血清学诊断，这对人医和兽医都很重要。在病原微生物方面已用于检查链球菌、沙门氏菌、布氏杆菌、结核杆菌、麻疯杆菌、霍乱弧菌、淋球菌、假丝酵母菌等的抗体，还可用于破伤风抗毒素和霍乱弧菌抗毒素的测定以及检测斑疹伤寒立克次氏体感染后的抗体，可作诊断。对立克次氏体还可用以鉴别密切有关的种属。也有用于检查鹦鹉热衣原体抗体的报导。试用于病毒抗体检查报告的有：流感病毒、腮腺炎病毒、麻诊、风疹、轮状病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒、肠道病毒、脑炎病毒、黄热病毒、狂犬病毒和脊髓灰质炎病毒等，其敏感性都超过目前常用的检查方法。此外，还可用于鉴定病毒型别，例如疱疹病毒。如能进一步改进方法用于检查特异性IgM，可以作为早期诊断以及了解体内有关抗原的清除情况。在免疫性疾病方面有试用作自身疫病抗体测定以及对过敏的诊断，例如检测各种过敏原的抗体、DNA抗体及甲状腺球蛋白抗体，红斑性痕疮抗体等等。在卫生学方面，可用于检测食品中葡萄球菌肠毒素及沙门氏菌毒素等等。
六、ELISA存在的问题
从以上的简单介绍中可以看出，ELISA法由于本身所具备的优越性，是一项很有发展前途的血清学诊断方法，而且应用的领域也越来越广泛。但是我们认为ELISA不是万应良方，用它来代替一切，这是不当的。因为ELISA法还有局限性：
1、由于ELISA所用的抗原大部分还是混合的可溶性抗原，所以对同一微生物寄生虫或其他物质不同部位的抗原还没有分开。
2、内源性过氧化酶的普遍存在，如人脑组织中，呼吸道分泌物的炎症细胞中及某些病毒的组织培养中均有内源性过氧化物酶的活力，常不易除去，如果用某些方法除去时，则病毒的抗原性亦受到破坏，对于用ELISA检测不利。
3、对ELISA法的非特异性评价的资料尚不够完善，因此，对出现一些非特异性反应的时候，往往不易解释。
4、固相载体的质量常不统一，主要是原料及制备工艺还不一致，致使不同批号的固相载体有时本底值较高，有时吸附性能很差，影响试验结果。
5、试剂不统一，现在处于“八仙过海，各显神通”，标准还不能统一。
下面将ELISA法与免疫荧光（IFA）和放射免疫(RIA)的各自优缺点作一简要的比较(表4),供参考:
表4:三种方法的优缺点比较:
| 方法种类 比较指标 | ELISA | RIA | IFA |
| 敏感性 | 高 | 高 | 较低 |
| 特异性 | 取决于抗原制备 | 同左 | 较高 |
| 重演性 | 尚满意 | 尚满意 | 尚满意 |
| 结果判断 | 客观 | 客观 | 有主观因素 |
| 抗原制备 | 较容易或复杂 | 同左 | 较容易 |
| 结合物制备 | 正在标准化 | 已标准化 | 已标准化 |
| 在野外条件下用于大量人群标本的普查 | 可以 | 困难 | 尚可以 |
| 分析自动化 | 可以 | 可以 | 困难 |
| 主要设备 | 酶标比色计 | 粒子计数器 | 荧光显微镜 |
| 试验成本 | 低 | 高 | 较高 |
| 试剂半衰期 | 长 | 短 | 长 |
| 对人的危害性 | 无或很少 | 有 | 无或很少 |
| 主要检测对象 | 抗体或抗原 | 抗原 | 抗原或抗体 |
| 应用范围 | 小的诊断实验室 | 大的中心实验室 | 小的诊断试验室 |
综上所述，ELISA在国内外已使用得非常广泛，但对该法在应用中的评价尚不一致，过去在ELISA法开始建立时有全面肯定的趋势，而在广泛研究和实践中发现了一些缺点，遇到了一些困难，如在重演性问题、特异性问题以及能否考核疗效问题等等。所以在70年代末期也有人采取否定的态度，全面肯定或全盘否定，这些都是不正确的，对一种新方法的建立和深入研究，要采取一分为二的方法加于评价，既要看到方法的优点，也要重视存在的问题，便于进一步研究加以克服。世界卫生组织专家组提出对ELISA的评价认为：“ELISA作为免疫诊断应用是一个好办法，但要做好它不容易。”因此，还需进一步研究改进，加以完善。从而使之成为对多种疾病诊断较为理想的方法是完全可能的。
