微卫星DNA分子标记及其应用
微卫星（Microsatellite，MS）又称短串联重复（Short Tandem Repeats，STR）或简单序列重复（Simple Sequnce Repeat，SSR），是指基因组中以少数几个核苷酸（多数为2-4个）为单位多次串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列。其中最常见的是双核苷酸重复，如（AC）n、（TG）n等，微卫星DNA广泛分布在真核生物的基因组中，大约每隔10-550kb就存在一个微卫星。微卫星DNA由于具有特异性的PCR扩增、多态信息容量（PIC）高、引物通用性好、突变率高、共显性等特点，已经被广泛应用。
1.微卫星DNA的特点及分类
微卫星DNA具有丰富的多态性，主要表现在核苷酸重复单位数目的多态性和重复序列中核苷酸的替换多态性。一般认为，一个微卫星DNA核心序列重复数目越高，其等位基因数目也就越多，多态性就越丰富。微卫星DNA遵循孟德尔遗传规律，能够稳定地从上一代传给下一代，且等位基因间呈现共显性遗传。除此以外，微卫星标记还具有DNA用量少、反应速度快、操作简易、结果重复性好等特点。
根据重复结构的不同可将微卫星DNA分为3类：完全重复型（perfect），单一序列单元无中断或无颠倒；不完全重复型（imperfect），单一序列单元有中断或有颠倒；混合型（compound），多个序列中单位有或无中断和有或无颠倒的混合。一般说来，微卫星DNA的重复序列两侧都有物种特异性的保守序列，所以，通过设计引物对基因组DNA进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳（或聚丙烯酰胺凝胶电泳）和放射自显影（或银染），就可以检测到在简单重复序列重复单位数不同的DNA区域的多态性，这就是微卫星DNA分子标记。
2.微卫星分子标记方法的优点
微卫星在基因组中是均匀分布的。Winter 等人的研究表明, 除着丝粒及端粒区域外, 染色体的其他区域均广泛分布有微卫星位点。Litt 和Luty以及Weber 和May各自用热稳定Tag 酶的PCR 方法证明, 微卫星具有丰富的多态性。用微卫星作为遗传标记与其他DNA分子标记(包括RFLP、RAPD 和小卫星DNA等) 相比具有以下优点。
2.1 微卫星标记杂合程度高
由于微卫星位点的等位基因数相当多，因而杂合程度高，多态信息含量（PIC）大，在区分亲缘关系极近的个体（群体）时的效率比PFLP高。
2.2 微卫星位点可通过PCR扩增
由于小卫星的等位基因一般比较大，在PCR扩增时有一定局限性。而使用微卫星进行PCR扩增，其使用样品数量少。另外，由于微卫星序列较短，即使降解的DNA也有可能包含足够用来扩增的微卫星位点，这一特点使那些保存差的样品也可能成为有价值的研究材料。
2.3 通用性与保守性
微卫星DNA所在区域在生物的基因组中是比较保守的，某一物种的微卫星引物可在相关密切的物种中使用，这使得减少获取微卫星的工作量和加快比较基因组作图的工作进度成为可能。
2.4 共显性遗传
微卫星DNA呈孟德尔共显性遗传模式，可以区别纯合显性个体和杂合显性个体，这为遗传研究提供了更多的可供分析的信息。
2.5 微卫星的多态性
多数SSR无功能作用，增加或减少几个重复序列的频率高，因而在品种间具有广泛位点变异，比RFLP及RAPD分子标记更具有多态性。
2.5.1 微卫星突变
微卫星的突变率很高，从而产生了很多等位基因，这就导致了微卫星的高度多态性，一般认为，微卫星丰富的多态性是微卫星不稳定性（microsatellite instability，MI）的表现。微卫星的突变速率在不同物种以及同一物种的不同位点甚至在同一位点的不同等位基因间都存在着很大的差异。在哺乳动物中，大多数的微卫星的突变率估计为每世代10-6-10-2人类家系的微卫星平均突变速率为10-4；黑腹果蝇受控雌性系中的突变率为每个位点10-6左右。当微卫星被表达在缺乏有效错配修复系统的寄主中时，其不稳定性要比正常时高（5-10）×103左右。
2.5.2 微卫星突变的产生机制
微卫星突变的遗传学机制现在尚不清楚，目前大多认为微卫星的不稳定性或者与DNA重组过程中的不等交换有关，或者与DNA复制过程中的“滑链错配”有关。
Johnson和Pupko等认为，两条染色体间的DNA重组过程中发生的不等交换以及基因转换可能是引起微卫星多态性产生的主要原因。而Levinson等认为在DNA复制合成的过程中，发生了局部解链，有微卫星存在的区域新生链和模板链相对滑动，产生错配，使得一个或者几个重复单位形成环状未能参与配对，从而导致了微卫星多态性的产生。
3. 微卫星分子标记技术的应用
微卫星DNA 作为遗传标记具有很大的优越性。近年来随着研究的不断深入,对微卫星标记的研究不仅具有重要的理论意义, 而且还具有较好的应用前景。
3.1 微卫星多态性分析
在自然界中,生物个体表现出来的各种遗传变异,在本质上就是DNA 的差异,因此通过研究DNA的变异来分析群体的遗传结构及遗传多样性更为直接。微卫星其重复单位数量可能不完全相同,因而形成多态性,即SSR 分子标记,这可能是由于有丝分裂过程中同源微卫星间的不等交换或复制过程“链滑”(strand slippage) 作用造成的。微卫星多态性反映着物种的进化历史,共有的等位基因在该物种基因组中最为古老、保守。与蛋白质标记技术相比较,利用微卫星标记估计的群体遗传杂合度和遗传距离明显优于蛋白质多态性标记,而且在分析遗传关系较近的种群和品种时,微卫星标记比蛋白质标记具有更为准确的数值。
3.2 群体遗传多样性
Powell 等指出微卫星比其他分子标记如RFLP、RAPD、AFLP 更能揭示遗传多样性。Scott 等根据从5000个葡萄表达序列标签( ESTS) 中分离的124 个微卫星而设计的16 对SSR 引物,对7 个葡萄资源进行分析。结果证明: 在3’非翻译区(3’U TR) 分离的微卫星在品种间具有较高的多态性；在5’非翻译区(5’U TR) 分离的微卫星在种和品种间具有较高的多态性；而在编码区分离的微卫星在种和属间具有较高多态性。Fahima 等的实验证实,单子叶植物大麦及双子叶植物鹰嘴豆也存在串联排列( GTAT) n和简单重复序列( GACA) n ,而且显示出高度多态性。Plaschke 等用23 个SSR 标记对40 份欧洲小麦品种进行检测,共发现142 个SSR多态性位点,平均每个SSR 标记能检测到6.2 个多态性位点。郭小平等用137 对有扩增产物的引物对2 个玉米自交系B14 和B96 进行分析,发现有67 对引物显示多态性,反映了这2 个自交系在遗传物质上的差异。杨官品等用一个多拷贝微卫星DNA 标记分析了238 份栽培水稻的遗传多样性及遗传多样性从农家品种到现栽培品种的动态变化,共检测出16 种长度变异类型和32种表现型,表现了较高的多态性。Turuspekov Y等用微卫星引物分析了代表日本主要栽培地区的18 种大麦品种的遗传多样性,Shannon信息含量最高的是Kanto 地区,为0.524；而含量最低的是Tohoku 地区,为0.264。遗传距离从Tohoku 和Tozan 地区的0.105 到Shikoku 和Kyushu 地区的0.88 。通过聚类分析表明,同一地区栽培的品种大都归为一类,这反应了大麦在日本在栽培不但受历史亲缘关系的影响,同时也有地理和环境因素的影响。Tanya P 等用SSR 对5 个韩国大豆品种、8 个泰国大豆品种和3 个野生大豆进行了遗传多样性分析。
3.3 基因定位及构建遗传连锁图谱
由于微卫星重复单位数量多，重复单位片段短，且重复程度不一样，同一类微卫星可分布在整个基因组的不同位置上，可将随机PCR标记沿着染色体锚定在已知位置，因而可以用作功能基因定位。由于微卫星标记来源于基因本身的序列，因而通过对微卫星标记的定位，也就相应地定位了其来源基因。Beckmman和Soller 认为, 多态的签条微卫星( Sequence -tagged Microsatellite site ,STMS) 对基因定位提供了有效的标记。
遗传连锁图谱是利用遗传标记进行连锁分析来反应遗传标记之间的相对关系。现在使用最广泛的是微卫星标记。其基本原理是：以微卫星位点为基础，在基因组中每隔一定距离找一个多态性的微卫星标记，当这些标记达到足够的饱和度（约每隔10-20cm一个，并覆盖90%的基因组）后，则可借助微卫星标记找到基因组中的任何功能基因和QTL，并进行连锁分析，从而确定QTL在图谱的位置、与标记之间的遗传距离和QTL的表型效应。Akkaga等将121个微卫星标记整合到水稻四个群体的RFLP框架图上，平均每16-20cm就有一个微卫星标记。拟南芥、水稻、番茄、土豆和玉米在遗传图谱上1cm分别相当于物理距离的150kb、300kb、500kb、1000kb和1500kb。相信随着分子遗传标记技术尤其是微卫星技术的进一步完善,对于构建基因文库将会起到进一步的推动作用。
3.4 构建指纹图谱
基因组中各微卫星位点除重复数不同外，其碱基组成和结构是相似的，因此可以以微卫星的核心序列如（AC）n、（TG）n等作为多位点探针，在基因组中同时检测多个位点。由于不同个体、品种（系）或群体在被检测位点上存在一定的差异，通过电泳及杂交，这些差异将表现为杂交带的有无，即产生微卫星DNA指纹图。B.Beyerman等通过DNA指纹印迹技术，利用简单重复序列（GATA）1和（GTG）5作探针，证实了大麦和甜菜DNA指纹印迹区带的显著差异。
3.5 用于种质鉴定和品种分类
由于微卫星座位的复等位性，使它易于鉴别同一物种的不同基因型。Guilford等利用（GA）15（GT）15作为探针筛选苹果基因组文库，证明了这些重复序列的多态性，并且利用3个微卫星标记就能足以区分21个苹果品种。Akagi等利用高度多变的含（AT）n的17个微卫星标记，成功地区分了59个亲缘关系极近的粳稻品种。Aranzana MJ用SSR对100个桃品种进行分析，用7个多态性微卫星位点得到32个等位基因，可区分78个不同的基因型。
3.6 分子标记辅助选择
微卫星标记应用于标记辅助选择具有很大的潜力，它改变了从表型值推断基因型值的选择过程。分子标记辅助选择相对于传统的表型选择来说，可以获得更大的遗传进展，尤其对于低遗传力性状、限制性状和后期表达的性状，能增大选择强度，缩短世代间隔，提高选择的准确性。Zhang等利用微卫星标记来预测产量和估计杂种优势。
4. 展望
微卫星DNA的研究近年来已取得了明显进展,但微卫星DNA标记还存在很多问题，如微卫星DNA分子突变机制尚不完全清楚、PCR引物在不同物种间保守性较差、对于不同物种要进行特异性引物设计等，但微卫星DNA仍然是研究当前种内遗传变异中分辨率最高、揭示力最强的核DNA标记。相信随着微卫星DNA研究的不断深入，微卫星必将会在各个领域中有着更为广泛的应用。
