酶联免疫吸附试验及其应用（二）
三、ELISA的影响因素
这是ELISA检测中的重要部分，可从9个方面加以说明。
（一）固相载体：可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。由于微量反应板所用试剂量少，操作方便，适合于大规模应用。国产聚苯乙烯微量反应板（上海塑料三厂出品）目前已大量应用于ELISA测定，并且获得了满意的结果。但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型及其表面性质有关。特别是塑料制品在加工过程中因工艺不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异，甚至完全丧失吸附能力。因此，对每批制品在使用前，必须经过实验室鉴定，鉴定的方法和标准是对每批购置的微量反应板或塑料管抽样，用0.2ug/ml纯化的正常人IgG进行包被，经洗涤后加酶标记抗人球蛋白进行反应，再经孵育洗涤，加底物显色终止反应后，逐孔在酶标比色计中测定其消光值、光密度（O.D值）。一般认为全板中每两孔间O.D值的误差不超过10%为合格。如果中间孔与四周孔O.D值相差太大，或者反应板的这一边与另一边凹孔的O.D值相差大，均不合格。此外，还要检查阳性和阴性参考血清O.D值是否有明显差别。一般要求有10倍左右的差异为合格，微量反应板或塑料管在使用前并不一定通过特殊处理。用蒸馏水冲洗即可应用。
（二）抗原：在ELISA中，包被于固相载体表面的抗原或抗体的来源和制备方法对试验结果都有影响。包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。经试验证明，适用于其他血清学试验的抗原并非均适合用于ELISA法。因此，对某一疾病的诊断，必须通过实践，才能选出适用的优质抗原。对大多数传染病和寄生虫病的血清学诊断中所用的抗原并非要求十分严格，一般能用于补体结合试验的可溶性抗原均可用于ELISA，例如超声波抗原、冻融抗原、细菌的外膜抗原、脂多糖（LPS）、细菌的外毒素以及用表面活性剂(如SDS)所提取的抗原等，在作ELISA时，必须要有1-2种试剂、要求纯化，但用表面活性剂提取的抗原在包被前必须透析除去表面活性剂，否则就不易吸附到固相载体上去。此外，对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。在用特异性抗体包被固相载体时也要提纯。用抗原或抗体蛋白包被固相载体时选择的浓度要适当。如浓度太高，则低效价抗体可能测不出来，或包被过量形成多层抗原吸附，故在操作过程中可能脱落从而降低敏感性和可重复性。用最适稀释度抗原，包被固相载体不仅经济，而且可以克服前带现象。那么用多大浓度抗原进行包被最为合适呢？可通过棋盘滴定法进行测定，但用单项滴定法更为简便，其方法是将抗原进行一系列稀释包被微量反应板，再用一定稀释度的阳性参考血清和阴性参考血清进行孵育后洗涤，再加酶结合物进行反应，经孵育洗涤后，加底物溶液显色，终止反应后分别测定O.D值，选择O.D值≥1.0的那个抗原稀释度为最适包被浓度。一般总是要选择那个O.D值稍大于1.0，而不选择小于1.0的抗原浓度。阴性参考血清O.D值要求<0.1-0.2。也就是要求阳性参考血清和阴性参考血清的O.D值有明显差别。抗原包被固相载体除浓度外，对时间、温度、PH均有关系。温度高（如37℃、45℃、或56℃），包被时间可缩短，温度低可延长包被时间。但为了方便起见，通常采用4℃包被过夜，可使抗原吸附得更加完全且均匀。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反应板或塑料管作固相载体时，在碱性条件下（如0.1mol/L、PH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原）4℃包被过夜较为合适。但在某些试验中，如用LPS或毒素蛋白包被时，用PH
7.2-7.4
PBS稀释才是满意的。包被特异蛋白质的浓度为1-10ug/ml，而对某些病原微生物抗原以5-20ug/ml较为合适，但均应通过滴定。
（三）试验样品：血清、血浆或其他体液，均可作为ELISA的试验样品（标本）。但应注意分离血清时，血液要求放置室温中凝固收缩，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否则会使大部分IgM和少量IgG丧失活性。关于人血清在保存过程中抗体的稳定性报导尚不多。但一般认为作ELISA血清最好要新鲜，若要贮藏，必须少量分装保存于低温冰箱，并防止反复冻融。血浆可用肝素毛细管法采血，而血清可用滤纸片法采血。
被检血清或血浆标本，可用含保护性封阻剂（吐温-20）或称湿润剂的缓冲液来稀释。也可加入一些蛋白质，如1%牛血清白蛋白等来稀释。然后再加到已经用抗原或抗体包被的固相载体中进行孵育。此种被试标本可作一系列稀释度测定，也可用一个稀释度测定。对于作某一个传染病的诊断来说，最好先用一系列稀释度作一批标本测定，求出对诊断有意义的一个稀释度（即测定剂量反应曲线），然后用一个稀释测定即可。最适稀释度和孵育时间均需从实践中摸索出来，对一般病原微生物所引起的传染病的血清学诊断，以1：200稀释度测定比较适当，而试验标本的(即含抗体)作用时间一般为室温或37℃
1-2小时。但现在对有些标本（如流脑抗原）测定时，仅用37℃ 5分钟。对单克隆抗体检测也可缩短作用时间。
（四）结合物：在ELISA中，用酶标记的抗体或抗原统称为结合物，此为进行ELISA检测的关键试剂。常规使用ELISA法的主要问题是能够简便地制备酶结合物，而此种制备好的酶结合物要求稳定，具有很高的酶活性，抗原或抗体的特异性，产量高及成本低。
用什么样的酶来标记抗原或抗体呢？可根据以下几点来选择适当的酶。
1、酶制品的纯度及活力高，催化效力也高，放大倍数大（即一个酶分子能催化几十几百个底物分子发生反应的酶）。
2、酶及制备好的酶结合物在检测或贮存中能保持稳定。
3、酶制剂易得、价廉.
4、既要适用于标记抗原，又适用于标记抗体，标记后不影响抗原或抗体的免疫学特性，也不降低酶的活性。
5、酶的反应产物稳定，检测时简便、快速。在定量测定中产物必须是可溶性的。
6、要有安全、价廉、易得的底物。
符合上述条件的酶有：碱性磷酸酶，一般用分子量为5×105（Alkaline
Phospatase,简称AP），辣根过氧化物酶（Horse Radish
Peroxidase,简称HRP,分子量为4×104）,另外尚有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖甙酶，糖化酶及乙酰胆碱酯酶等等。其中以前两种（AP和HRP）最为常用。
AP活力高，制备好的酶结合物可加NaN3防腐，但此种酶不易获得，因其是从小牛肠粘膜中或大肠杆菌中提取，而且价格比较昂贵。因此，目前国内外大多使用HRP。HRP活性也高，价格较便宜。但制得酶结合物不能加NaN3防腐。因NaN3能抑制HRP的活性，但可作低温保存或加60%缓冲甘油等量混合后少量分装，保存冰箱，一般可用1-2年。
由于HRP最为常用，故先把HRP的一般性质介绍一下，以便在制备酶结合物时可引起注意。(HRP的性质):HRP系从辣根菜的根中所提取，这种酶是无色酶蛋白与暗棕色的铁卟NH2啉（E铁血素）相结合的一种醣蛋白，可简写成Fe-E
，由多个（6-7个）同功CH2OH酶所组成。分子量约为40000，等电点为PH7.2。能被58-62%饱和硫酸铵沉淀，在PH3.5-12均较稳定。63℃15分钟，室温数周、甲苯和其他苯类有机溶剂处理都不影响它的活性。
由于HRP中的酶蛋白和铁卟啉分别在波长280nm和403nm有二个最大吸收峰，其两者的比值，即O.D403nm/O.D280nm称为RZ值（系由德文Reinnoit-Zah）而来，表示酶的纯度。高纯度酶制品RZ值可达3.4。而RZ值0.6的酶其中非酶蛋白含量高达75%。不适合作ELISA用，经纯化后才能应用。目前我们国产的HRP
RZ值达2.5-3.0，亦可作ELISA用。
抗体：制备酶结合物的抗体最好要提纯。被标记的抗体要求效价及亲和力都要高，因为纯化抗体可增加反应的特异性。如果采用级特异性的酶结合物（例如酶标抗IgM、酶标抗IgG）。有助于区别活动性感染（早期诊断）和已过性感染（追朔诊断）。但在大多数情况下，用抗血清中的全球蛋白成份与酶结合所制成的结合物亦可应用，而且相当稳定。其方法是用硫酸铵沉淀抗血清三次（50%饱和的1次，33%饱和的2次），经透析除盐，即可用于标记。或者经DEAE-纤维素柱层析后所制成的IgG亦可标记。如将IgG再通过葡聚糖凝胶G-200胶滤（用PH7.2
PBS洗脱）所得纯化IgG用HRP标记则更佳。但损失较大，也有人用亲和层析法提纯抗体来标记的。但在用酶来标记抗体前，需测定一下抗体球蛋白效价和蛋白含量。一般用Beutner氏琼脂糖散法测效价（即玻片双相琼脂扩散法），中央孔加1mg/ml抗原，周围孔加不同稀释度粗制或提纯抗体（马或羊抗人IgG），室温扩散24小时，沉淀反应效价达到1：16以上者即可应用。而蛋白质含量可用751紫外线分光光度计测定，也可用Folin酚法测定。
结合：用什么样的方法将HRP与抗体球蛋白结合起来呢？当然不能用强烈的方法，因为强烈的方法会使酶和抗体失去活性。故只能用温和的方法把酶和抗体结合起来。因此，必须使用结合剂。理想的结合剂应具备下列条件：（1）不影响酶及抗体活性，（2）不产生干扰物质，（3）抗体和酶结合后应有较高的产量，（4）不出现非特异性反应,(5)结合程序简便，（6）来源易、价廉。目前常用的有戊二醛和过碘酸钠二种。由于对所使用结合剂的针对性，因此标记的方法也有戊二醛交联法和过碘酸钠氧化法两类。
1、戊二醛交联法：戊二醛是一种能使蛋白质与蛋白质联结最常用的双功能试剂。它有2个对称的活性醛基，可分别与酶蛋白和免疫球蛋白上的游离氨基（酚基、味唑基、巯基）以共价键边接起来而形成的酶结合物。例如酶（Fe-E-NH2CH2OH，）通过戊二醛与免疫球蛋白（Ig-NH2）的交联反应式如下：
NH2
Fe—E 
CH2OH +OHC-(CH2)3-CHO + H2N-Ig----> Fe-E-N=C-(CH2)3-C=N-Ig+2H2O
H H
酶 低聚醣基团 戊二醛 免疫球蛋白 酶结合物 水
用戊二醛标记又可分为一步法和二步法。一步法主要是将酶、抗体球蛋白和戊二醛同时混合而直接制备。此法虽然简单，但因酶蛋白的活性氨基少，免疫球蛋白的活性氨基多，在戊二醛作用下，容易形成免疫球蛋白的聚合物，当然也可形成酶蛋白的聚合物。因而，形成酶标记抗体的比例较少，同时抗体和酶的活性丧失较多，结合物的酶活性较低，但较简便。戊二醛二步法中先用过量的戊二醛与酶作用，使戊二醛上的一个活性醛基先与酶蛋白上的一个氨基结合后，除去过量戊二醛（可通过葡聚糖凝胶G-25过柱或用透析法除去），然后，再加入抗体球蛋白，使之与酶--戊二醛复合物反应，形成酶结合物。而酶结合物的多余醛基可用加入小分子的氨基酸如赖氨酸除去，于稳定酶结合物的特异性。在戊二醛二步法中，酶本身并不产生缩合，因为在第二步酶分子上的一个游离氨基仅与戊二醛上的一个活性醛基联结，而戊二醛上另一个活性醛基则可与第二步加入的抗体球蛋白分子上的氨基结合生成酶结合物，因此，两步法优点是能生成均一的酶结合物，大多可使一个分子酶与一个分子球蛋白作用，抗体和酶的活性损失较少，所得酶结合物活性比一步法高10倍左右。
其方法是将10mg
HRP溶于0.2ml含1.25%戊二醛的PH 6.8 0.1mol/L
PBS中，置室温18小时，充分透析或经葡聚糖凝胶G-25层析除去多余戊二醛，加生理盐水至1ml，然后加入5mg纯化的抗体球蛋白及0.1ml PH
9.6的1 mol/L碳酸盐缓冲液，混合后于4℃冰箱放置24小时，加入0.1ml 0.2 mol/L的赖氨酸溶液，室温置2小时，用PH
7.2、0.15 mol/L PBS充分透析，藉离心除去沉淀，上清即为酶结合物。必要时可作进一步纯化后使用。
2、过碘酸钠氧化法：本法是目前酶标记抗体较好的方法，能使70%酶与90%以上球蛋白结合。采用本法首先是用氟代二硝基苯（Fluoro
dinitro bengene
2.4—硝基苯，FDNB）封闭HRP表面的游离氨基（亦可用甲醛或戊二醛来封闭），从而提高酶结合抗体球蛋白的能力，避免酶的自身交联。然后用过碘酸钠来氧化HRP表面结构的醣链部份（即低聚醣基团）使成醛基，使其直接与抗体球蛋白上的游离氨基形成共价键而结合。最后用硼氢酸钠还原，使HRP表面醛基能充分与抗体球蛋白上氨基进行反应，使之形成稳定的结合物。其反应式如下:
NH2 N=CH2 N=CH2
(1) Fe—E CH2OH +HCHO----> Fe—E CH2OH +H2O
NaIO4
N=CH2 
N=CH2
(2) Fe—E CH2OH +O---->Fe— ECHO + H2O
N=CH2 N= CH2
(3) Fe—E CHO +H2N-Ig---> Fe—E C=N-Ig + H2O
H
其标记步骤是：10mg
HRP溶于新鲜配制的0.3 mol/L PH
8.1碳酸氢钠2ml中，加0.2ml1%氟代二硝基苯无水乙醇溶液，室温中搅拌1小时以封闭HRP表面的游离氨基。再加2ml 0.08 mol/L
NaIO4水溶液，于室温中轻搅30分钟，用0.16 mol/L乙二醇溶液终止氧化反应。1小时后移入透析袋中置0.01 mol/L PH
9.5的碳酸盐缓冲液中透析过夜，除去试剂，透析袋中的即为醛化酶。
取6ml醛化酶加20mg抗体球蛋白（用2ml碳酸盐缓冲液溶解），混匀，室温搅拌2-3小时后加10mg硼氢酸钠盐，4℃冰箱4小时或过夜。次日取出加等量饱和硫酸铵沉淀酶结合物(去游离酶)，并用50%饱和硫酸铵洗涤1-2次。再溶于3ml
PH 7.4 PBS中，并置透析袋经透析除盐，如有沉淀藉离心除去。上清酶结合物加入等量60%甘油PBS，分装保存，冰箱备用。
