基因芯片杂交结果中的常见问题
问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
杂交点模糊、毛边 | DNA浓度过高 | 降低DNA探针浓度进行芯片的打印 |
紫外交联时未能有效固化DNA | 检测紫外灯，将其能量值调试至合适值；将打印好的芯片置80℃烤2~4h。 | |
杂交时盖片移动 | 杂交时将盖片放正，杂交过程中避免其移动；预先用水和普通载玻片练习放置盖玻片。 | |
没有进行封闭，或封闭不完全 | 用琥珀酸酐进行封闭 | |
各点形状不规则 | 打印针头折断或弯曲 | 检查打印针头，更换已弯曲的针头 |
针头不干净 | 清洁打印针头 | |
针头打印点后向上移动速度太快 | 减少针头从打印点向上移动的距离约25% | |
背景区出现荧光点 | 样品核酸中掺入的荧光染料过多或过少 | 每份样品核酸应含约20pmol/L的荧光染料；杂交前应检测样品核酸的特异活性，应达到平均每25~50个核苷酸含1个染料分子。 |
样品核酸的荧光衰减 | 荧光染料及标记好的样品核酸应避光保存 | |
芯片打印或杂交时污染了手套上的粉尘 | 芯片制备和检测的所有过程中应使用无粉尘的手套 | |
芯片上沾染了空气中灰尘 | 在无尘工作橱或环境中操作 | |
未掺入样品核酸的荧光染料在芯片上的非特异性结合 | 纯化标记样品核酸时，建议采用PCR纯化试剂盒，勿用0.5ml超离心装置。 | |
杂交前cDNA样品应充分热变性，保证成单链状态。 | ||
高背景或背景不均匀 | 杂交时，盖片与芯片间出现气泡，气泡部位样品核酸不能与芯片上的DNA杂交 | 小气泡会在杂交过程中自然消失，无需处理。 |
倾斜芯片或盖片，使得气泡移动到上部后自然消失。 | ||
杂交前先用水和普通玻片练习如何正确放置盖玻片。 | ||
采用疏水性（聚丙烯）盖玻片（如Grace Biolabs的HS-66 22mm×60mm盖玻片）。 | ||
杂交后清洗不充分（这种情况经常出现） | 每次清洗均应使用新鲜配制的溶液。200ml清洗皿中最多同时洗4张芯片。 | |
严格按操作说明洗够充足的时间和次数。 | ||
样品溶液中混有未结合荧光染料的核酸 | PCR纯化柱用前应按说明进行酸化，勿用0.5ml超离心装置 | |
杂交时间过长 | 减少杂交时间。通常6~8h已足够。 | |
因样品核酸标记时荧光染料的掺入不足，为增强杂交信号而加入过多样品 | 杂交前应检测样品核酸的活性，应达到平均每25~50个核苷酸含1个染料分子 | |
打印好的芯片保存不当 | 打印好而暂时不做杂交的芯片应立即置于专用盒中，铝箔密封，再放入干燥器中 | |
出现异常杂交模式 | 与不同样品杂交的芯片在同一缓冲液和清洗液中清洗 | 不同样品杂交的芯片应单独清洗，均用新鲜清洗溶液 |
盖片周围出现相同的强荧光信号 | 杂交时样品核酸溢出 | 确保杂交时湿度适宜。盖玻片的放置一定要到位。增加样品核酸用量。 |
