蛋白质含量测定实验——考马斯亮蓝法
| 实验方法原理 | 考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。当考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从 465nm 变为 595nm。在考马斯亮蓝 G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝 G-250 从吸收峰为 465nm 的形式转变成吸收峰为 595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、试剂与器材 1. 试剂 （1） 标准蛋白质溶液，用 G-球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0 mg/ml和0.1 mg/ml的标准蛋白质溶液。 （2） 考马斯亮兰G-250染料试剂：称100 mg考马斯亮兰G-250，溶于50 ml 95%的乙醇后，再加入120 ml 85%的磷酸，用水稀释至1 L。
2. 器材 可见光分光光度计、 旋涡混合器、 试管16支。 二、操作方法 1. 标准方法
（2） 加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1 ml H2O加5.0 ml G-250试剂。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 考马斯亮兰法实验表
（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5 mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。 2. 微量法 当样品中蛋白质浓度较稀时（10-100 mg/ml），可将取样量（包括补加的水）加大到0.5 ml或1.0 ml，空白对照则分别为0.5 ml或1.0 ml H2O， 考马斯亮蓝G-250试剂仍加5.0 ml，同时作相应的标准曲线，测定595 nm的光吸收值。 0.05 mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。 展开 |
| 注意事项 | Bradford法比Lowry法要简单迅速，是测定蛋白质浓度的选用方法。有些物质会干扰这种检测反应，它们是甘油、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、和一些碱性缓冲系统。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除大部分这些干扰物质的影响。 |
| 其他 | 一、bradford法的突出优点 1. 灵敏度高，据估计比lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。 2. 测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间。 3. 干扰物质少。如干扰lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 二、bradford法的缺点
1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 G-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Ttriton x-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1 N的氢氧化钠。（如同0.1 N的酸干扰lowary法一样）。 3. 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 展开 |
