植物体内可溶性蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝法和LOWRY法
实验 植物体内可溶性蛋白质含量的测定
植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。
一、考马斯亮蓝法
【原理】
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。
【仪器与用具】
分光光度计，10ml量筒1支；研体；10ml容量瓶1支；1ml刻度吸管3支；10ml具塞刻度试管14支。
【试剂】
（1）牛血清白蛋白 配成1000μg/ml和100μg/ml；
（2）考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温下可放置一个月；
（3）90%乙醇；（4）磷酸（85%，W/V）。
【方法】
1.标准曲线的绘制
（1）0～100μg/ml标准曲线的制作 取6支试管，按表28-1数据配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min后，在595nm下比色，绘制标准曲线。
表28-1 配制0～100μg/ml血清白蛋白液
管 号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
100μg/ml牛血清蛋白量(ml) 蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(mg) | 0 1.0 0 | 0.2 0.8 0.02 | 0.4 0.6 0.04 | 0.6 0.4 0.06 | 0.8 0.2 0.08 | 1.0 0 0.10 |
（2）0～1000μg/ml标准曲线的制作 另取6支试管，按表28-2数据配制0～1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。与步骤（1）操作相同，绘出0～1000μg/ml的标准曲线。
表28-2 配制0～1000μg/ml血清蛋白血液
管 号 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
1000μg/ml牛血清白蛋白（ml） 蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(mg) | 0 1.0 0 | 0.2 0.8 0.2 | 0.4 0.6 0.4 | 0.6 0.4 0.6 | 0.8 0.2 0.8 | 1.0 0 1.0 |
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定 吸取样品提取液0.1ml（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。
3.结果计算
样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=
式中 C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；
V－提取液总体积（ml）；
a－测定所取提取液体积（ml）；
W－取样量（g）。
二、LOWRY法
【原理】
Lowry法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，再加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。因此，Lowry法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3～15倍，为双缩脲法100倍。由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。
Lowry法的试剂由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜溶液），可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，因此蛋白质的酪氨酸和胱氨酸等可显色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。
【仪器与用具】
试管若干；刻度吸管0.5ml，1ml，10ml；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管一套（带橡胶管）；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50μl；分光光度计。
【试剂】
Na2WO4・2H2O；Na2MoO4・2H2O；85% H3PO4；浓HCl；Li2SO4・H2O；溴水；酚酞指示剂；Na2CO3；NaOH；CuSO4・5H2O；酒石酸钾钠；
牛血清白蛋白：用水配成250mg/ml。
【方法】
1.酚试剂的制备
（1）取Na2WO4・2H2O100g，Na2MoO4・2H2O25g及蒸馏水700ml于1500ml的圆底烧瓶中，之后加入85% H3PO4 50ml，浓HCl 100ml。安上回流冷却装置（使用磨口接头。用软木塞或橡皮塞时，必须用锡泊包起来），使其慢慢沸腾10h。冷却后加入Li2SO4・H2O150g，水50ml，浓HCl 100ml安上回流冷却装置，开口加热煮沸15min，以逐出过量的溴。冷却后稀释至100ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存。
使用时用标准NaOH溶液滴定，以酚酞为指示剂。滴定终点由蓝变灰。滴定后算出酸浓度，用时适量稀释，使最后浓度为1mol/L H＋，此为Folin-酚试剂乙液。
（2）首先配制①4% Na2CO3溶液；②0.2mol/L NaOH溶液；③1% CuSO4溶液；④2%酒后石酸钾钠溶液；使用前①与②等体积混合配成Na2CO3-NaOH溶液；将③与④等体积混合配成硫酸铜一酒石酸钾钠溶液。然后将这两个溶液按50�1混合；配成Folin-酚试剂甲液。此试剂只能用一天。
2.标准曲线的绘制
（1）取7只试管编号,分别加0ml，0.1ml，0.2ml，0.4ml，O.6ml，0.8ml，1.0ml标准蛋白质溶液，用水补到1ml，便成为每管含蛋白为0mg，25mg，50mg，100mg，150mg，200mg，250mg标准系列（必要时可做重复）。
（2）加5ml试剂甲，混匀，于30℃放置10min。
（3）喷射加入0.5ml试剂乙，立即振荡混匀，在30℃下保温30min。
（4）准确到30分后，以不加标准蛋白的管为空白，在500nm波长下比色测定吸光度值。
（5）以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
3.样品测定
（1）取50μl样液加入试管中，（样液提取一般按0.1g鲜样/ml比例，提取方法见各酶活测定）加蒸馏水补至1ml，然后重复步骤2的（2），（3），（4），以空白为参比，测吸光度值。
（2）根据吸光度值，查标准曲线求得蛋白质含量。
4.结果计算
蛋白质含量（mg/g鲜重）＝
式中 C－查标准曲线得样品测定管中蛋白质含量（mg）；
V－提取液总量（ml）；
a－测定时取样液量（ml）；
W－取样量（g）。
【注意事项】
1.Folin试剂乙只在酸性条件稳定，故当其加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前，还原反应即能发生。
2.为了保证反应进行完全，反应在25～30℃水浴中进行，反应30min后准时比色。
3.还原物质干扰本实验。
【方法评述】
上述两种方法均是灵敏度为微克级的高灵敏度定量测定蛋白质方法，前者稳定，后者简便；二者均优于现有的其它方法。二者的缺点是：Lowry法受植物体内存在的酚类物质干扰；考马斯亮蓝法在蛋白质含量很高时线性关系稍偏低，且不同蛋白质与色素结合状况有差异。
