植物体内可溶性蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝法)
植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类,测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时,常以比活(酶活力单位/mg蛋白)表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此,测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。
【原理】
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色,当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色,前者最大光吸收在465nm,后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内(0~100μg/ml),蛋白质-色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速,其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏,可测微克级蛋白质含量,所以是一种比较好的蛋白质定量法。
【仪器与用具】
分光光度计,10ml量筒1支;研体;10ml容量瓶1支;1ml刻度吸管3支;10ml具塞刻度试管14支。
【试剂】
(1)牛血清白蛋白 配成1000μg/ml和100μg/ml;
(2)考马斯亮蓝G-250:称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中,加入85%(W/V)磷酸100ml,最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温下可放置一个月;
(3)90%乙醇;(4)磷酸(85%,W/V)。
【方法】
1.标准曲线的绘制
(1)0~100μg/ml标准曲线的制作取6支试管,按表28-1数据配制0~100μg/ml血清白蛋白液各1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml,分别放入10ml具塞试管中,加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂,盖塞,反转混合数次,放置2min后,在595nm下比色,绘制标准曲线。
表28-1配制0~100μg/ml血清白蛋白液
管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
100μg/ml牛血清蛋白量(ml) 蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(mg) |
0 1.0 0 |
0.2 0.8 0.02 |
0.4 0.6 0.04 |
0.6 0.4 0.06 |
0.8 0.2 0.08 |
1.0 0 0.10 |
(2)0~1000μg/ml标准曲线的制作另取6支试管,按表28-2数据配制0~1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。与步骤(1)操作相同,绘出0~1000μg/ml的标准曲线。
表28-2配制0~1000μg/ml血清蛋白血液
管号 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
1000μg/ml牛血清白蛋白(ml) 蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(mg) |
0 1.0 0 |
0.2 0.8 0.2 |
0.4 0.6 0.4 |
0.6 0.4 0.6 |
0.8 0.2 0.8 |
1.0 0 1.0 |
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取样品提取液0.1ml(样品提取见各酶活测定),放入具塞刻度试管中(设两个重复管),加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂,充分混合,放置2min后在595nm下比色,记录吸光度值,通过标准曲线查得蛋白质含量。
3.结果计算
样品蛋白质含量(mg/g鲜重)=
式中C-查标准曲线所得每管蛋白质含量(mg);
V-提取液总体积(ml);
a-测定所取提取液体积(ml);
W-取样量(g)。