环核苷酸依赖性蛋白激酶分析实验
基本方案
| 实验方法原理 | |
|---|---|
| 实验材料 | 具有环核苷酸依赖性蛋白激酶活性的酶样品 10 mg／ml 组蛋白 2B（溶于水） |
| 试剂、试剂盒 | [γ-32P] ATP 溶液 5 × 环核苷酸依赖性蛋白激酶反应缓冲液 20 × 环核苷酸 |
| 仪器、耗材 | 30℃ 水浴 |
| 实验步骤 |
1. 每个分析反应按以下比例将反应组分加入 1.5 ml 微量离心管中，保持冰浴： 5 × 环核苷酸依赖性蛋白激酶反应缓冲液 1 μl 10 mg/ml 组蛋白 2B 1 [γ-32P] ATP 溶液（ATP 终浓度为 5 μmol/L，放射活性为 5 μlCi/μl） 1 μl 20 × 环核苷酸 0～13 μl 水 盖好离心管，混匀，放入 30℃ 水浴。 每一反应做三份并设立无底物、酶、环核苷酸等各组分的实验对照。每个反应的体积为 20 μl。 2. 加入 1～14 μl 有环核苷酸依赖性蛋白激酶活性的预冷酶样品，开始反应。酶的加量取决于样品中酶活性的大小，在预试验中所得最大反应值可衡量磷酸转移反应的程度。 3. 30℃，温育 10 min。 4. 按不同的分析方法加入适当的试剂停止反应：加入 20 μl 10 % 预冷的 TCA 进行 TCA 沉淀，或 10～20 μl 预冷的 2 × SDS - PAGE 样品缓冲液进行电泳分析。
展开 |
| 注意事项 |
1. 在反应中为了保持磷酸基与底物的线性结合关系可适当减小酶的加量。 2. 对于吸附在 Sepharose 珠上的免疫沉淀的酶样品，先制备没有酶源的反应混合物，预热后加入免疫沉淀物。在免疫沉淀物分析时建议将容积扩大为 100 μl，可在 75 μl 反应缓冲液中加入 25 μl 吸附着免疫沉淀物的凝胶珠。 |
