酪蛋白激酶分析实验_用多肽底物
| 实验方法原理 | 酪蛋白激酶 I 可用多肽 AspAspAspGluGluSerIleThrArgArg 进行分析，最近酿蛋白激酶 II 也已被特异性的多肽底物分析，如 ArgArgArgGluGluGluThrGluGluGlu（下划线残基是磷酸受体）。两个多肽均可通过精氨酸残基结合到 P81 磷酸纤维素膜上。第一个多肽对酪蛋白激酶 I 相对比较特异，但它的磷酸化反应动力并不理想，其 Km 值大小在毫摩尔范围。因此只有在此酶的纯度很高时用于酪蛋白激酶 I 分析比较理想。 |
|---|---|
| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 每个分析反应按以下比例将各反应组分加入 1.5 ml 微量离心管中： 10 μl 5 × 酪蛋白激酶反应缓冲液 5 μl 10 mmol/L用于酪蛋白激酶分析的合成肽底物溶液 5 μl [γ-32P] ATP溶液（ATP终浓度为5 μmol/L，放射活性为5 μCi/μl） 0~30 μl 水 盖好离心管，放入 30℃ 水浴温育 10 min。每个反应的容积为 50 μl，加入水的量取决于加入酶样品的量。 2. 加入 1～30 μl 有酪蛋白激酶活性的酶样品开始反应。 3. 30°C 水浴，10 min。 4. 按不同的分析目的和方法加入适当的试剂停止反应：20 μl 预冷 10 % TCA 进行 TCA 沉淀，或 10～20 μl 预冷的 2 × SDS-PAGE 样品缓冲液进行电泳分析。 可用 10 μl 的反应混合物点膜，使酶吸附在 P81 磷酸纤维素膜上。用那些方法中的一种继续进行分析。 展开 |
| 注意事项 | 加入酶量的容积取决于样品中酶活性的大小。在预试验中所得的最大反应值可衡量磷酸转移反应的程度。在反应中为了保持磷酸基与底物的线性结合关系可适当减小酶的加量。 |
推荐
