高通量SNP分子分型技术(KASP技术)经验分享
重要的事情说三遍，终于可以开始实验了,但在实验前或实验中乃在实验后,根据小编多年的经验,您可能会遇到以下问题,不用担心,待小编为您一一解答.
1.引物设计提交序列时的注意事项有哪些？
我们要求所提交的序列长度至少为目标位点上下游各50bp。请注意序列来源，尽量保证序列准确，多态性位点BLAST结果证明为单拷贝也就是要特异。标注出不确定的序列及引物设计时需要跳过的碱基和序列，目标位点周围其他多态性位点（最多可以有2个）用IUPAC码标注。
2. PCR反应体系是怎样的？
96孔板，10μL 体系，其中5μL DNA， 5μL mix, 0.14 μL引物。
384孔板，5μL体系，其中2.5μL DNA ， 2.5 μL mix, 0.07μL引物。
384 Array Tape, 1.6μL 体系，其中0.8 μL DNA, 0.8μL mix, 0.022μL 引物。
1536孔板，1ul 体系，其中1.5 μL DNA （烘干），1 μL mix, 0.014μL引物。
3. KASP技术对DNA有什么要求？
建议最小的DNA浓度为2.5 ng / μL。根据基因组大小，所需的DNA的量为：待测样品基因组/3000Mb*5ng。建议设置DNA浓度梯度实验，来确定最合适的DNA浓度。 KASP 对DNA纯度的要求不高， 一般粗提的DNA即可满足，但请尽量保证DNA浓度的一致性, 提取及溶解过程中尽量不要用到EDTA， 因为 EDTA会阻止KASP酶的作用。如有EDTA，建议将DNA稀释一下，做一下浓度梯度实验或加MgCl2优化。
4. 多个引物可以同时跑在同一块板子上吗？
可以，但KASP技术要求每个引物至少跑22个样品加两个NTC，否则可能影响分群判读，造成较大的误差。
5. NTC信号值很高，怎么办？
NTC跑很高可能有三个原因，一是NTC被DNA样品污染，二是循环数太多，引物 自身扩增。建议多加几个NTC，注意污染问题，再看看。三是，引物设计问题，扩增产物中有引物二聚体存在， 建议重新设计引物。
6. 为什么需要recycling(加循环）, 什么时候需要加循环？
我们以36个循环作为标准的反应程序,由于不同的引物扩增速度及效率不同,部分引物在36个循环时并不能达到反应终点，导致荧光信号较低，分群较分散，影响数据分析。因此，当您发现在跑了36个循环时信号值较低，分群较分散但有分群趋势，即可选择加循环（94度--20秒，57度--60秒，3个循环）。如果NTC没有扩增，最多可加4次循环。
7. KASP 试剂的储存条件及建议是什么？
KASP 引物及Master mix 可在4度保存一周，建议储存在-20度/-80度， Master mix需避光保存， 避免反复冻融（尽量冻融不要超过3次），建议事先将其分装。保存得当，可延长KASP试剂的使用寿命至2-3年。
8. 用qPCR仪做KASP genotyping, 有哪些注意事项？
请确定您的qPCR仪型号，订购合适ROX水平的Master mix。请在40度以下读取KASP的终点荧光信号，分析数据时请注意调整XY坐标轴最大最小值相当。所有数据均建议在Autocall 后进行人工判读。如有可能，建议样品板中加阳性对照DNA。
9. 目标片段GC含量太高或太低有什么建议？
对于高GC含量片段（GC%>65%）的扩增，建议首先尝试把标准的touch down 程序(61oC-55oC) 改成68oC-62oC。如果效果不好，再尝试加5%-10%Master mix 体积的DMSO。关于低GC含量的片段扩增（GC%<40%），建议首先尝试将touchdown 取消，改为两步法。如果效果不好，再尝试加0.63% 或1.06% Master mix 体积的MgCl2。
10. 反应完成后的PCR板还可保存多长时间？
反应完成后的PCR板可在4度保存一周，荧光信号仍会比较稳定。一周之内加循环或重读数据均可。
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