RAPD（随机扩增多态性DNA）分析技术
实验方法原理
RAPD作为单引物的PCR扩增产物，其产生机理是引物首先结合到模板链，沿模板5’端方向延伸而产生不同长度的DNA片段，然后以这些片段为模板继续大量扩增。由于RAPD反应中，在3’端没有相应引物和模板互补，这样必然存在一个由引物沿模板DNA 5’端方向延伸后再在3’端形成同一引物互补序列的过程。
有人提出，在RAPD反应过程中，扩增可能存在一些这样的分子模式：
（1）5’端带有引物的单链DNA分子在3’端发生折转、自身结合和延伸，并在3’端形成同一引物的互补序列，变性展开后即可成为单引物PCR扩增的模板分子。
（2）通过两条5’端各带同一引物的单链DNA分子拼联来实现。
（3）对基因组DNA分子的颠倒重复序列而言，如果引物的结合位置正好处于这些序列的3’端，那么在其DNA片段的两条单链上就分别具有一个引物的结合位置和它互补的序列，成了RAPD扩增的模板分子。在双引物通用PCR中这种情况很少，但由于RAPD所用引物短，又在低温下退火，这增加了引物和颠倒重复序列结合的机会，完全有可能产生RAPD。
实验材料 模板DNA
试剂、试剂盒 寡核苷酸引物dNTPsTaq DNA聚合酶PCR缓冲液矿物油电泳所需试剂
仪器、耗材 PCR扩增仪电泳装置微量离心机微量移液器Eppendorf管紫外线观察装置及照相设备
实验步骤
一、 试验条件
1. 药品试剂
（1）模板DNA（10～100 ng）
（2）寡核苷酸引物（20 mmol/L贮存液，可向Operon Technologies或Perkin Elmer公司购买，也可以自己合成）
（3）0.2 mmol/L dNTPs（必须使用高质量的dNTPs，这一点非常重要。dNTPs经反复化冻后会发生降解，因此应分成小份保存。应注意混合物中四种dNTP的量要相等）
（4）Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer，Norwalk，Connecticut）
（5）10×PCR缓冲液（500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，100 mmol/L Tris HCl，pH 8.3）
（6）矿物油
（7）电泳所需试剂
2. 仪器设备
PCR扩增仪、电泳装置、微量离心机、微量移液器（1～20 ml和20～200 ml）、0.5 ml Eppendorf管、紫外线观察装置及照相设备。
二、 操作程序
在冰里向无菌的Eppendorf管中加入以下反应物：
水： 14.75 ml
10×缓冲液： 2 ml
10×dNTPs：2 ml
引物（20 mmol/L）：0.2 ml
Taq DNA聚合酶
终体积
DNA（10～100ng）：1 ml
石蜡油 ：20 ml
2. 93℃反应2 min后开始如下循环：
93℃变性反应：1 min
36℃退火反应：1 min
72℃延伸反应：1.5 min
经过45个循环后，最后一个循环72℃增加5 min，循环结束后反应产物置于4℃保存。
3. 20 ml反应产物走凝胶电泳，经溴化乙锭染色检测扩增的情况。
注意事项
其他
一、应注意的问题及解决办法
扩增偏差或无扩增。
（1）在部分或全部管中缺少一个组分。重复少量几个反应以确定所有的PCR组分是否都已加入。
（2）PCR抑制物可能与DNA一起纯化，改变DNA的浓度。
