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放射免疫分析(RIA)中影响标准曲线建立的因素（一）

2020.9.01

放射免疫分析(RIA)是由美国生物学家Yalow和Berson于1959年创建的一种体外放射分析技术，该技术有其结果可靠。简便易行，成本低廉，高灵敏度，高特异性的优点。其超微量测定可达ng至pg水平，目前可测物质已达300余种，对临床的诊断和治疗起着积极而重要的作用。在实际工作实践中，标准曲线的制做非常重要。它可对整批实验结果产生重大影响。在放免分析测定中被测物质浓度是根据标准曲线计算得来的。标准曲线的精确度直接影响测定结果的精确度。而根据少数的几个离散点建立起来的标准曲线如何尽量精确地反应B/B0％与样品抗原浓度之间的真实函数关系，却要尽可能地从实验中把关，因此制定标准曲线的每一步骤都要严格和精确。现就放免分析中有关标准曲线制做的影响因素进行一番分析。供同仁们参考。

一、试剂组份

（一）标准品标

准品的活性、免疫反应性以及纯度往往影响放射免疫分析的正确性，从而极大地影响结果。

要求标准品活性与免疫反应性和被测物质相一致，须是同源系统的。且稳定性好，易保存，不含交叉反应物质和干扰免疫反应的物质，定量应准确并与国际标准品一致。所谓标准品纯度不是指化学纯，它可以含杂质，但不应含有对放射免疫分析有干扰的物质。

（二）蛋白质

标准品与专一性抗体在平衡反应过程中，蛋白质有抑制作用，如被测物质应用血浆或血清，应在标准品内加入相同量的蛋白质，这样蛋白质对被测物质及标准品的干扰反应相一致。

（三）PH值和离子强度

抗原抗体反应在酸性或碱性环境中解离，因此该反应宜在接近中性或微碱性的环境中进行。其PH值以7.4-7.8为宜，离子强度 0.05-0.1mol/L。既要有缓冲能力（离子强度不能太小），但离子强度过大又会阻止抗原抗体反应。

（四）反应容积、温度及时问

缩小反应容积可减少抗体和标记抗原的绝对用量，使非标记抗原的竞争力相应加强，能提高灵敏度，且反映试剂消耗减少。另一方面，由于小容积形成复合物的绝对量相应减少，放射性测量误差增大，而且由于加样容积变小，也易引起操作误差，一般宜先0.3-1.2ml的反应容积。抗原抗体反应达到动态平衡需要一定时间，同时受温度的影响，反应温度每升高l0℃（不超过37℃）抗原抗体结合达到平衡的速度提高一倍，但温度升高会使抗原抗体反应的亲和力下降；而温度过高（60℃）时，则会使抗原抗体失活。通常情况下，所测样品含量高，抗血清亲和常数大，可选择较高的温度（37℃）进行较短时间的温育。但复合物结合牢度较差；若被测物含量低，抗血清亲和常数K较小时，应在4℃下较长时间温育，复合物结合牢度较大。不易解离。因此，放免室宜备空调环境，低温离心机温度应控制在15℃，以保证反应生成的沉淀物不易解离。

（五）肽酶、补体

某些物质如TRI-I，胰高血糖素等生物制品可受肽酶影响产生降解，所以在测定缓冲液中应加入一定量的抑肽酶，以抑制肽类激素的分解，此外，蛋白质激素及肽类激素作标准时，补体能影响抗原一抗体反应。

（六）抗血清

抗血清品质优劣直接影响标准曲线的建立。其主要质量指标应具有高效价、高亲和力和高特异性，非特异性的交叉反应率要小。使用抗血清稀释度要合适，稀释度过大，会使剂量反应曲线发生明显右移，在RIA分析中要兼顾尽可能大的抗体稀释度，又要具有很高的测定灵敏度。