间接 ELISA法
实验概要
Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA。指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。
主要试剂
碳酸氢盐/碳酸盐包被缓冲液 (100 mM)
PBS
封闭液
洗涤液
抗体稀释缓冲液
实验步骤
1. 包被抗原
1) 用 PBS 或碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度 20 μg/ml。吸取 50 μl 稀释抗原到 PVC 酶标板上的第一排孔，按要求往后进行系列稀释。
2) 酶标板上覆盖封口膜，室温孵育 2 小时，或者 4 °C 过夜。孵育时间需要优化。
3) 倒掉包被液，用 PBS 洗板 3 次，每孔 200 μl。在水池上轻甩倒掉洗液，在纸巾上轻拍酶标板除去残留液体。
2. 封闭
1) 用含 5% 脱脂奶粉或含 5% 血清的 PBS 缓冲液封闭酶标板上剩余的蛋白结合位点，每孔加 200 μl。也可用其他封闭剂如 block ACE、BSA（牛血清蛋白）代替。
2) 封口膜覆盖酶标板室温至少孵育 2 小时，或者 4 °C 过夜。
3) PBS 洗板 2 次。
3. 加一抗和二抗进行孵育
1) 每孔加入 100 μl 稀释好的一抗。
2) 封口膜覆盖酶标板室温孵育 2 小时，孵育时间需要进行优化。通常 2 小时孵育即可获得足够强的信号，但如果获得的信号较弱时，可4 °C 孵育过夜获得较强信号。
3) PBS 洗板 4 次。
4) 加标记二抗，每孔 100 μl。稀释到最佳浓度（参照说明书），使用前用封闭液现配。
5) 封口膜覆盖酶标板室温孵育 1-2 小时。
6) PBS 洗板 4 次。
4. 检测
1) 用多通道吸液器向每孔加入 100 μl（或 50 μl）底物。
2) 显示出足够深的颜色后，加终止液每孔 100 μl（如有必要）。
3) 酶标仪读取吸光度值（光密度）。
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焦点事件
