肺炎支原体的临床微生物学特征
对支原体的研究始于人类探索家畜传染性疾病的病原，1898年法国Nocard及Roux用含动物血清的人工培养基从患牛肺疫的病灶中首次分离，当时命名为胸膜肺炎微生物(Pleuopneumonia organism，PPO)。随后在各地区不同类型动物标本中分离出同类微生物，因形态及培养特性与PPO相似，逐又统称为类胸膜肺炎微生物(Pleuopneumonia like organism，PPLO)。
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)是目前人类致病支原体中研究最多、较为了解的一种。1944年Eaton自原发性非典型肺炎患者呼吸道分泌物中分离出一种致病因子，给地鼠接种后可引起肺炎，给健康志愿者接种后可产生非典型肺炎症状，该病原体能通过细菌滤器，故被考虑为一种病毒，称Eaton因子。
一、微生物学特征
无论就细胞直径或基因组大小而言，支原体都是能够进行自我复制的、有能力在体外不依靠活体细胞而生存的最小微生物。因无细胞壁，肺炎支原体呈多形性，多为纺锤体状，长约1～2 μm，宽约0.1～0.2 μm，其细胞体积往往小于典型细菌的5%。
1996年完成MP基因组测序。MP基因组共有687个基因，全长816 394 bp[5]。而大肠埃希菌的基因组全长4 600 000 bp，比MP长近5倍。MP未发现氨基酸合成的基因，同时也缺乏合成复杂细胞壁结构的基因，涉及DNA修复、DNA重组、细胞分裂及蛋白分泌的基因数量也比复杂细菌少。MP较小的基因组长度以及有限的生物合成能力限制了它的生物合成和代谢能力，导致需要非常复杂的培养基添加成分才能在体外进行分离培养。胆固醇是支原体三层细胞膜的重要结构，而支原体本身没有合成能力。
二、致病性
MP仅寄生在人类中，为黏膜病原体，在宿主呼吸道黏膜上皮细胞内寄生。MP的丝状体顶端有特殊结构，结构中可见透明腔中围绕着一个浓厚的核状中心，为其黏附于宿主呼吸道上皮细胞的结合点。顶端结构目前被认为是MP与宿主相互作用的最主要结构。MP侵入呼吸道后，借滑行运动定位于纤毛毡的隐窝内，以其顶端结构牢固地黏附于上皮细胞表面的受体，能抵抗黏膜纤毛的清除和吞噬细胞的吞噬，并继而产生一系列细胞毒性作用。MP主要黏附因子是对胰蛋白酶敏感的大分子表面蛋白，称为P1蛋白。P1蛋白相对分子质量约为170 000，是一种膜表面蛋白，主要聚集在MP外膜顶端结构中，呈簇状排列，可介导MP黏附到呼吸道上皮细胞表面[7,8,9,10,11,12,13,14]，这种黏附是MP繁殖和致病的先决条件。
有关MP致病性的更多内容可参阅本期刊文"肺炎支原体感染的致病机制"。
三、分离培养
MP培养费时费力而且价格不菲，期间需要配制特殊而昂贵的培养基、并需经过多次盲传以及长达数周的孵育时间，因此临床实验室开展不多。与分子生物学方法如PCR相比，即使在非常有经验的实验室，培养方法的敏感性不超过60%。但是，MP培养阳性的诊断特异性接近100%，并能对分离株进行菌种鉴定、分型及药敏实验，故仍具有重要的临床意义。
1．标本类型和采集：
理想条件下，源于呼吸道任何部位的标本均可进行肺炎支原体的分离培养，包括鼻咽和咽喉拭子、痰、胸腔积液、支气管肺泡灌洗液、气管吸取物及肺组织。如果是拭子，需在标本采集时多加用力旋转以获得尽可能多的上皮细胞。推荐使用铝制或塑料杆的藻酸钙、涤纶和聚酯拭子。木杆拭子可能对支原体生长有潜在抑制作用应尽量避免使用。
2．标本运送和贮存：
MP对外界环境非常敏感，尤其是干燥和高温。标本应尽可能在床旁接种于适当的运送培养基或支原体培养基。运送培养基可直接使用SP4培养基，也可使用2SP(10%热灭活小牛血清＋0.2 mol/L蔗糖，配成0.02 mol/L磷酸盐缓冲液)或胰蛋白酶大豆肉汤加0.5%胎牛血清。
3．培养方法：
为了提高临床标本中肺炎支原体检出率，可在接种标本后将液体培养基浓度自10–1梯度稀释至10–3，并同时接种固体培养基。梯度递减稀释法可以减少某些内在抑制物影响。组织接种前需切碎。MP专用培养基中必须含有葡萄糖作为代谢底物，同时还应包括血清(作为胆固醇来源)、酵母提取物以及pH显色剂。
4．液体培养结果判读和传代：
MP孵育培养的时间从4 d至数周不等，最佳生长期可能需要21 d或更长。在液体培养基中，由于MP分解葡萄糖产酸使酚红显色剂变为黄色。但细菌生长也利用葡萄糖产酸使培养基变色，需加以鉴别，细菌污染时培养基多呈混浊。所有变色液体培养基需要传代至新鲜液体(0.1 ml接种至0.9 ml)和固体(0.02 ml接种)培养基中。
5．固体培养：
应每3～5天利用显微镜观察固体培养基，要正确鉴别支原体菌落与其他人工产物，如气泡、水滴、脂粒或碎片。初次分离的MP菌落多呈圆形、隆起，如水滴状，无外晕。多次传代后可呈典型煎蛋状。有菌落生长的培养基可将琼脂小块切下转入液体培养基继续孵育纯化，变色后用以保存菌株。
6．鉴定：
如果接种临床呼吸道标本的SP4液体培养基变色，且固体培养基上出现缓慢生长圆形菌落，应考虑MP可能，进一步可采用血清学和PCR方法明确。
四、体外药物敏感性试验
美国临床与实验室标准委员会(CLSI)2011年颁布了支原体体外药敏测定的指南，微量稀释法被推荐用于MP最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)测定。以下作简单介绍：首先需测定MP菌落计数。将培养液每管分装0.9 ml，吸取对应的阳性菌液0.1 ml加入其中，混匀后吸取0.1 ml至第二管，如此顺序作6倍递增稀释10–1～10–6，每个稀释度取20 μl接种固体平板，37 ℃孵育。显微镜下计数平板上的菌落，并计算获得临床分离株的菌落计数。（参考文献：略）
