利用双光子活体成像的方式对角膜干细胞进行观察记录
复层扁平上皮又被称为复层鳞状上皮（Stratified squamous epithelia），通常存在于皮肤、食道以及口腔等部位的表面，会经历不断的再生过程，在此过程中终末分化的细胞从表面脱落并由具有干性的细胞进行补充。由于细胞不断丢失，复层扁平上皮必须处于一种动态平衡状态，以维持其组织结构和功能的正常运行。其中，角膜是一种独特的复层扁平上皮，具有典型的组织学特征和屏障功能，但是其干细胞组织的方式与食道等区域并不相同。角膜位于眼球的表面，对视力至关重要，它是眼睛的保护屏障并且可以将光线折射到视网膜上。角膜上皮中的干细胞具有一定分层结构，并驻留在一个叫做角膜缘（Limbus）的特殊组织中。但是一直以来，角膜缘处单个干细胞的行为是什么样的还未被直接可视化地观测过，因此角膜缘中细胞组成的异质性以及功能的多样性还未可知。
近日，来自美国宾夕法尼亚大学Panteleimon Rompolas研究组在Cell Stem Cell杂志上发表题为Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche的文章，利用双光子活体成像的方式对角膜干细胞以及其子代细胞的活性进行了系统性、长时期的观察和记录。
为了对小鼠的角膜进行观察，作者们建立了一种可以直接对小鼠眼睛进行长期观测的、基于双光子显微镜的活体成像技术（图1）。关于小鼠以及人类中角膜缘内干细胞的标记物有一定的区分，但是目前为止还没有特异性确认可以只标记这些干细胞的标记物5。因此，作者们提出一种方案，可以通过无偏地标记单个细胞，并通过活体成像直接追踪其各自的谱系，随后回顾性地确定角膜缘内所有潜在的干细胞群。为此，作者们利用p63CreERT2在复层扁平上皮活性对其中的细胞进行标记，通过联用双荧光的报告子最终可以标记角膜、角膜缘以及结膜组成的整个表面上皮中的干细胞和祖细胞。在对完整的眼球进行成像后，使用相同的参数可以对小鼠的眼睛再次进行成像，可以在诱导之后对其中的细胞进行长时程观察。作者们发现在角膜缘的细胞克隆与胶原纤维束以及血管共同定位，其中还包括一些角膜的神经以及免疫细胞。另外，根据细胞分布的位置、行为等，作者们发现角膜缘中至少存在两种特异的细胞群，随后作者们根据这两种细胞群距离角膜的位置将其分别称为内角膜缘细胞（Inner limbus）以及外角膜缘细胞（Outter limbus）。
图1 基于双光子的角膜缘活体成像实验方案
通过活体成像记录实验，作者们发现外角膜缘细胞群体中存在一群缓慢分裂细胞。在追踪后只在持续分裂的细胞中能够保荧光信号。通过对成像的数据进行分析，作者们发现荧光信号保留的细胞行为存在异质性。比如保留荧光标记的细胞进行分裂后，子细胞始终保持在相同的位置，没有发生终末分化。也有部分被标记的细胞会在整个成像期间保持静息状态。进一步地，作者们想知道这些分裂缓慢的荧光标记细胞是否是维持角膜稳态的祖细胞来源。为了回答该问题，作者们引入了一个在角蛋白启动子控制下的光激活GFP转基因小鼠品系，在光激活可以在细胞核中产生显著的信号，该信号会随着细胞的分裂被逐渐稀释。通过该实验，作者们发现这些分裂缓慢的荧光标记细胞正是维持角膜稳态的来源。
为了进一步评估角膜缘干细胞的功能，作者们利用飞秒脉冲激光在原位进行特异性干细胞消融，同时保持周围细胞龛的完整性，防止造成对于周围组织的损伤。在对内角膜缘细胞进行消融后，可以观察到角膜细胞克隆在干细胞移除后不能持续生长，并且出现向角膜中心的退化。那外角膜缘细胞在损伤后的反应是什么呢？为此，作者们在角膜中央划伤，并追踪位于角膜外缘的细胞的反应。作者们发现有证据表明，在伤口愈合过程中，来自外角膜缘的细胞离开原本的位置并扩展到角膜区域，放射状的谱系会在角膜受伤后出现持续数周。该结果发现，角膜缘区域中的内角膜缘细胞和外角膜缘细胞在角膜稳态维持以及伤口愈合方面具有不同的功能。
图2 工作模型
总的来说，该工作通过双光子显微镜为基础的长时程活体成像实验，揭开了小鼠复层扁平上皮组织角膜中存在稳态维持以及谱系再生这两种功能的谱系。内角膜缘干细胞主要进行对称分裂，维持祖细胞的数量以支持角膜稳态；外角膜缘干细胞促进角膜损伤后的再生。该研究为不同的干细胞群体的功能多样性提供了新的见解。
