血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析
前言
血小板活化试验，对于血小板功能、心血管疾病的研究，有重要意义。使用流式细胞仪进行多参数分析，可以特异灵敏地检测血小板表面标记，了解血小板的活化状态和反应性，并同时获得更多关于血小板的信息。在疾病监测、抗血小板治疗病人的筛选及治疗监测、预测并发症等方面有良好的应用前景。
使用推荐的三色流式分析方法检测血小板活化的优点是：
检测血小板的反应性。
了解血小板活化进程。血小板先发生膜糖蛋白变化，然后是胞浆内颗粒释放到血小板外。
同时检测多种血小板表面标志。
高度灵敏。
直接检测血小板的多种标志。
使用全血，标本量少。
操作简便快捷，将血小板人工激活减至最低。
BDIS血小板活化试剂组成为：
PAC-1 FITC：早期血小板活化的标志物，即活化的 gpⅡb/Ⅲa复合物，抗体与活化后血小板膜表面的gpⅡb/Ⅲa复合物纤维蛋白原结合位点相结合。BDIS抗体为IgM型，建议使用PAC-1结合阻断剂RGDS做阴性对照。
CD62P PE：血小板活化后期的标志物，特异地与活化血小板结合。静止血小板胞浆内a颗粒含有CD62P，血小板活化时，颗粒内糖蛋白向膜外释放，血小板表面表达CD62P。
CD61 PerCP：特异的泛血小板表面标记，既与活化血小板结合，也与未活化血小板结合。CD61与CD41联合，即为血小板表面gpⅡb/Ⅲa复合物。在本试验中，用FL3设阈值。
试验用品
采血管：枸橼酸钠抗凝的真空采血管。
一次性12×75 mm Falcon试管。
微量加样器和加样头。
BD抗体：2-8℃保存。
荧光抗体 | FITC | PE | PerCP |
对照管 | PAC-1+RGDS | IgG1 | CD61 |
试验管 | PAC-1 | CD62P | CD61 |
RGDS (PAC-1阻断剂)：用PBS配制，10mg/ml。
血小板激活剂：ADP，浓度2′10-4M，2-8℃保存。也可选用其他激活剂，如PMA、纤维蛋白、TRAP。
PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8℃保存。
固定液：含1%多聚甲醛的PBS缓冲液，2-8℃可保存一周。
振荡混匀器。
FACS流式细胞仪：进行数据获取。
CaliBRITE Beads/FACSComp软件：FACS仪器校正，预设获取条件。
CellQuest软件：试验数据获取和分析软件。
操作步骤
1. 标本采集：
(1)采血管顺序编号。
(2)抽取静脉血，采血管中注入2ml。
(3)于10分钟之内完成血小板激活和染色步骤，操作时应注意减少人工激活。
2. 血小板激活：
(1)试管内加入50mlADP，450ml全血，轻轻摇匀。
(2)室温孵育5分钟。
(3)立即染色。
3. 荧光抗体染色：
(1)Falcon管编号。
(2)在对照管中加入PE同型对照、CD61 PerCP、PAC-1各20ml，RGDS加10ml。
(3)在试验管中加入三种抗体各20ml。
(4)在对照管和试验管中各加入未激活或激活的血标本5ml。
(5)轻轻混匀，室温暗处孵育15-20分钟。
(6)各管中加入1ml冷的固定液 (2-8℃)，充分混匀， 2-8℃阴暗处放置30分钟。
(7)24小时内上机分析。
4. 上机获取数据：
(1)开机：
检查鞘液筒装满，废液筒倒空。
先打开流式细胞仪，再打开计算机。
仪器气路加压，排空气泡。
做FACSComp。
(2)打开CellQuest，顺序放置对照管和试验管，获取数据：
调出 获取条件，FSC和SSC选择Log方式。
获取条件为CD61 PerCP阳性。
使用对照管调整FL1和FL2的PMT，使阴性群体位于FL1 vs FL2点图左下角。
分别使用PAC-1 FITC / IgG1 PE / CD61 PerCP和PAC-1 FITC+ RGDS / CD 62P PE / CD61 PerCP调整FL2-FL1和FL1-FL2补偿。
获取各管的试验数据。
5.结果分析：
在CD61 vs SSC点图中设门找血小板群。 CD61 vs SSC 点图显示有三群，CD61阳性/低SSC一群主要由单个血小板组成，CD61阳性/高SSC一群主要由黏附血小板的血细胞组成， CD61阳性/散射光更低的一群主要由血小板来源的碎片组成。由于在生理和病理情况下，血小板群和红细胞群的大小、颗粒度会有交叉，因此，不建议使用FSC-SSC图设门。
在CD61 vs SSC点图中找出CD61 PerCP阳性的血小板群 (单个血小板和黏附在WBC上的血小板)，设门。门内做PAC-1 FITC vs CD62P PE点图的双参数分析，统计结果。
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注意事项
1. 采血时请用大号针管，抽出的前2ml血应弃去不用。
2. 尽量避免标本受到物理振动。
3. 取血后10分钟内完成染色操作。
4. 在Falcon管中加血标本5ml，管壁上不能有残留血，未染色的部分会影响试验结果。
5.为了检测和控制血小板体外激活，建议使用正常未受激活的血标本平行做质量控制。
附：BDIS血小板活化试剂
BD抗体：
CD | Ig Subclass | Form | Catalog No. | Tests |
PAC-1 | IgM | FITC | 340507 | 50 |
CD62P | IgG1 | PE | 348107 | 100 |
CD61 | IgG1 | PerCP | 340506 | 50 |
Mouse g1 | Platelet/Intracellular | PE | 340013 | 50mg |
CaliBRITE 3 | Unlabeled,FITC,PE,PerCP | 340486 | 25 |
辅助试剂：
浓度 | 用途 | |
RGDS | 10mg/ml in PBS | PAC-1阻断剂，用于PAC-1的阴性质控 |
ADP | 0.2mM | 活化血小板 |
多聚甲醛 | 1% in PBS | 固定液 |
PBS或生理盐水 | 鞘液 | |
枸橼酸钠 | 抗凝剂 |
