多肽类药物的药代动力学研究
蛋白多肽类药物的体内检测难度很大，要求检测方法应具有高度的专属性，以及极高的灵敏度。传统的光谱法、生物检定和免疫分析等方法均有一定的局限性，而LC-MS/MS集高效液相色谱的高分离性能与质谱的高灵敏度、高专属性于一体，已迅速成为药物代谢与药物动力学研究中采用的主要分析方法。
戈舍瑞林（Goserelin）是一种治疗乳癌和前列腺癌的多肽类药物，艾塞那肽（Exenatide）是首个化学全合成的肠促胰岛素类似物，可降低2型糖尿病患者的空腹和餐后血糖。
和传统药物比较，蛋白多肽类药物的体内检测面临相当大的难度，其主要原因是：一，这类药物多为生理活性物质，化学结构特殊，稳定性差，体内处置十分复杂。二，生物体内存在大量干扰物质，如结构相同或相似的内源性蛋白多肽类物质，细胞因子、蛋白类治疗药物降解产物、体液基质、体内结合蛋白以及针对治疗药物的抗体等。故要求检测方法应高度特异，如何特异地将目标蛋白多肽分子与干扰物质区分是一大难题。三，该类药物生理活性强，用药剂量很小，通常为微克级水平，致体液中药物浓度极低，故要求检测方法必须具有极高的灵敏度。
以往蛋白多肽研究主要依赖光谱法、生物检定和免疫分析等方法。其中光谱法的专属性和灵敏度较低，主要适用于分析生物样本中含量较高的药物；生物检定缺乏特异性、灵敏度差且耗时；免疫法的特点是快速、简便和灵敏度高，但该方法建立时须针对每一种药物制备特异性抗体和标记药物，通常需要购买相应的试剂盒，且不适用于多组份复杂药物的分析，所以主要局限于生化药物的样本分析。
LC-MS/MS检测的专属性和灵敏度等优势，已迅速成为药物代谢与药物动力学研究中采用的主要分析方法。
TSQ Vantage质谱仪的优越性能来源于它在离子传输方面的技术创新。新型的S形离子光学透镜系统使用新型的静电场技术捕获离子，并有效地将其传输进入双曲面四极杆质量分析器。相比以Skimmer为基础的离子传输设计，S形透镜设计具有显著的先进性，它可消除质量歧视，并降低昂贵的分子涡轮泵的气体负荷。这项创新设计可保持更干净离子光学传输路径，同时降低了背景噪音，提高了灵敏度。除此之外，TSQ Vantage质谱仪采用的四级杆是共轭双曲面四级杆，符合理论上四级杆中的电场分布，因而使其拥有高选择性离子检测模式，可以用于排除共流出物中质荷比相近化合物的污染，显著提高复杂样品中的灵敏度。总之，这套新系统使小分子、生物分子及多肽领域的科学家能够检测超痕量的化合物，并具有极佳的精密度和重现性。
实验部分
仪器与试剂
TSQ Vantage串联质谱仪（Thermo Fisher Scientific公司），配置Surveyor液相色谱系统（Thermo Fisher Scientific公司），Thermo Hypersil Gold C18柱（100×2.1mm，3μm）。
标准品：戈舍瑞林1.0mg，用甲醇:0.2%甲酸（80:20）配制并稀释成浓度为1.0 mg/ml的混合标准溶液；艾塞那肽1.0mg，用甲醇:0.2%甲酸（80:20）配制并稀释成浓度为1.0 mg/ml的混合标准溶液。
甲醇（德国Merck公司），甲酸（HPLC级，Thermo Fisher Scientific公司），水为二次蒸馏水。
色谱与质谱条件
戈舍瑞林色谱条件：Thermo Hypersil Gold C18柱（100×2.1mm，3μm），柱温35℃；流动相A为0.01%甲酸水溶液，流动相B为甲醇，采用梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：0.20ml/min；进样体积：10μl。
戈舍瑞林质谱条件： ESI正离子模式；喷雾电压：4.0KV；鞘气：25arb；辅助气：10arb；毛细管温度：380℃；碰撞气：氩气（1.5mtorr）。采用选择反应监测（SRM）扫描模式，戈舍瑞林的SRM参数见表3。
艾塞那肽色谱条件：Thermo Hypersil Gold C18柱（100×2.1mm，3μm），柱温35℃；流动相A为0.2%甲酸水溶液，流动相B为甲醇，采用梯度洗脱（洗脱程序见表2）；流速：0.20ml/min；进样体积：10μl。
艾塞那肽质谱条件： ESI正离子模式；喷雾电压：4.5 KV；鞘气：35arb；辅助气：10arb；毛细管温度：350℃；碰撞气：氩气（1.5 mtorr）。采用选择反应监测（SRM）扫描模式，艾塞那肽的SRM参数见表3。
结果与讨论
LC-MS/MS方法优化及灵敏度考察
经优化流动相和质谱参数，采用ESI正离子模式检测，经各质谱参数优化后，两种多肽类药物戈舍瑞林和艾塞那肽均有很高的灵敏度，定量限分别为2pg/ml和20pg/ml。碰撞能量优化结果见图1（a）和图1（b）。在该实验条件下所得典型LC-MS/MS色谱图见图2（a）~图2（d）。
方法的线性和重复性考察
戈舍瑞林：将浓度为1mg/ml的混合标准溶液逐级稀释成1000、200、100、20、10、5、2 pg/ml系列标准溶液，分别进样分析。以分析物子离子色谱峰面积对质量浓度作标准曲线，所得线性方程及线性系数见图3（a）。2 pg/ml样品连续进样3次，RSD为7.36%，重复性满足要求。
艾塞那肽：将浓度为1 mg/ml的混合标准溶液逐级稀释成2000、1000、200、100、50、20 pg/ml系列标准溶液，分别进样分析。以分析物子离子色谱峰面积对质量浓度作标准曲线，所得线性方程及线性系数见图3（b）。20 pg/ml样品连续进样3次，RSD为9.17%，重复性满足要求。
结论
实验表明，高效液相色谱－电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)检测方法灵敏度高，定量限分别达到了2 pg/ml和20 pg/ml，标准曲线线性良好，重复性满足要求。
除了考察标准溶液，实验中我们还以犬血浆基质预处理后添加样品（2ng/ml）为分析对象，分别考察了分辨率分别为FMWH=0.7和FMWH=0.2时的性噪比和选择性。结果表明，分析戈舍瑞林时，FMWH=0.2时样品的性噪比S/N提高2.3倍，选择性增强；分析艾塞那肽时，FMWH=0.2时样品的性噪比S/N提高了5倍，同时在复杂基质中极大地改善了色谱分离度。结果表明，TSQ Vantage具有的高选择性离子检测模式可以极大地改善在复杂基质中样品的选择性和性噪比，尤其在血浆和组织这样复杂的生物样本中优势更为明显。
