关于酶切的一些小技巧
A．找不到适合的酶切位点。由于各厂家不定期的推出新的限制性内切酶品种，这些酶切识别序列可能尚未在有关Catalog 上出现，用现有的软件也查不到这些酶切点，如New England Biolabs 公司前一段时间刚推出了20多种新的内切酶。请随时向各厂家或供应商查询，并记得将新的品种加入到您的记录中以便查阅，这些新的内切酶有可能正是您要找的呢。
B．在文献上找到的内切酶在厂家目录上找不到。由于来源不同，许多识别序列，酶切点完全本同的酶会有不同的名字，各供应商目录往往会有相应的附录以供用户查询，比如在New
England Biolabs 的Catalog
后面20项或基因有限公司2000Catalag前面都附有相当完整的内切酶列表（含1999年以前绝大部分商品化的酶），从左边一栏寻找你已知的酶的名字，找到后可以查出相应的识别序列，各种同功酶的名称，
酶在NEB 厂家所用的名称和目录号等。另外也可以通过已知酶的识别序列在相应的表中找到相应的酶名称。当然这些表可能不含最新发现的酶。
C．Dam Den 甲基化对酶切点的影响。有时用试剂盒纯化的质粒用别的酶都切得动，用Bcl I ，等酶就是切不动。原因在于多数实验室常用的Ecoli 菌株都有甲基化的功能，而BclI是一个甲基化敏感的酶。当其识别序列被甲基化后BclI就出现切不动的情况。而Bam HI则对甲基化不敏感，所以甲基化与否都照切不误。当你要用BclI这类切点时，请选用甲基化缺陷的Ecoli 菌株如GM119 或其他菌种。有的内切酶对甲基化敏感与否取决于其识别序列两端的碱基，详细资料请参考厂家目录的有关附录，如NEB 目录268 、269 页。
D．同进进行双酶切要注意：
①任何时候2 种酶的总量不能超过反应体系的0.1②双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表（NEB 目录251 ）页，如果有一种buffer能2 使种酶的活力都超过70% 的话，即可用这种buffer. 如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可各取一半中和。
③如果2 个酶buffer成份相差较大或2 个酶的反应温度不同则必需分别做酶切。厂家目录一般都会有相应的附录以供查询各种酶的反应温度。
④第一个酶切后可以电泳确证酶切完全后从胶中回收DNA 再进行下次酶切也可以在第一个酶切后用PCR 产物回收试剂盒或Nucleotide Removal Kit纯化酶切样，保留少量做电泳分析之用后再进行下一次酶切。还有一种屯化管（eppendorf 等厂家有售），将酶切样加入后离心，盐等成份被甩掉而核酸则被截留在柱子中间的膜上，加入ddH2O 离心洗涤后加几微升在膜上，将柱子反转插入新的epperdorf 管上离心即可将DNA 片段离下来，做下一次酶切。
⑤特别注意，双酶切载体时如果2 个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序，因为不同的内切酶对其识别位点两端碱基数目要求不同，有的酶要求识别序列两端有多个碱基的必须先切，比如LITMUS29中先切BamHI 再切Hind 时就会出现切不动的情况。更详细的数据可参考相应的附录，如NEB 公司目录的259 页。
E．设计合成引物时加入酶切点往往为后继的实验带来很多方便，比如PRC 产物经酶切后可以定向克隆到载体中，但在设计时需注意不同的限制性内切酶对其识别位点两端的碱基数目要求不同。例如HindⅡCla Ⅰ，要求其识别序列5 端至少有多个碱基，这个酶才能切动，有的内切酶在两端碱基不同时切割效率也不同，设计引物时要特别注意。有关数据可查询各供应商附录表，如NEB 公司第258-259 页。
F．小量酶切时用较小的管化1.5 的管好，可以减少因为蒸发造成的体积减少，浓度改变。
