引物与模板链正确连接的保证因素
1. 退火温度很重要。
（1）引物与模板结合的温度参数。要保证退火温度足够低，保证引物与目的序列的有效结合；退火温度又要足够高，以减少非特异性结合。
（2）退火温度与碱基比例关系很大。
①GC（40%-60%），比例太高会使退火温度过高，从而无法实现引物与模板结合。
②两种引物碱基比例相似，以保证相同的退火温度。
2. 保证引物与模板特异性结合
（1）碱基要随机分布，且与模板内部序列没有较高的相似性。（即使这样还是会有个别碱基相连的情况，但是足够高的退火温度可以打开个别氢键）
（2）引物自身及两引物之间不应存在互补序列（少于5个相同的碱基连续排列）。
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