PCR反应体系（缓冲液、脱氧核苷三磷酸、引物、模板与DNA聚...
PCR反应体系（缓冲液、脱氧核苷三磷酸、引物、模板与DNA聚合酶）
1．缓冲液
标准的缓冲液含 10mM Tris·HCl ， pH 为 8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 ℃）下，pH 值接近 7.2
。缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 Mg2+ ，有时使用 Mn2+ 。一般以 MgCl2
的形式提供，标准浓度为 1.5mM 。 Mg2+ 浓度的高低会影响扩增的特异性和产率。缓冲液中还含有 50mM
的钾离子。有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含 G+C 模板的扩增效率。
2．脱氧核苷三磷酸（dNTP）
脱氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物，标准的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种 dNTP ，即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP ，终浓度一般为 200mM（即饱和浓度）。 dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。
3．引物
在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各 1mM ，即 1pmol/ml ， 在 100 μl 反应体系中相当于6x1013个分子。如果 5% 用于扩增 1kb 的 DNA 片段，可得到 3.3 μg 的产物，足以用于常规分析。
引物设计一般要考虑以下几个问题：
① 长度：至少 16bp ，通常为 18-30bp ，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。
② 引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5℃ 。对于小于 20 个碱基的引物其 Tm 值可用简易公式计算，即 Tm=4（G+C）+2（A+T）。 对于 14-70 个核苷酸的引物可用以下公式计算。
Tm=81.5+16.6（1g[K+]）+0.41（G+C）%-（675/N）
N 表示引物的核苷酸数目， [K+] 表示单价离子即钾离子的浓度。
③ 避免引物内部或引物之间存在互补序列（3个碱基），从而减少引物二聚体的形成以及引物内部二级结构的形成。
④ G+C 含量：尽量控制在 40% 至 60% 之间， 4 种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及 T 在 3' 末端的重复排列。
⑤ 引物的 3' 末端最好是 G 或 C ，但不要 GC 连排。
4．模板
模板的数量会直接影响扩增的效果。对于一般的 PCR 扩增，104至107个模板分子可达到满意的效果。用人类或哺乳动物基因组 DNA
进行扩增时，一般使用 1μg DNA , 相当于单拷贝基因有 3×105 个拷贝。以酵母菌、细菌、质粒和 M13 噬菌体噬菌斑的 DNA
作模板时，要达到这么多拷贝数分别需要 10ng，1ng，1pg 和 1% 噬菌斑。
5．DNA 聚合酶
① Taq DNA 聚合酶
来自嗜热古细菌的嗜热水生菌（Thermus aquaticus）， Taq DNA 聚合酶分子量大小为 94kDa ，为单分子酶，在 75℃
活性最强。具有 5'-3' 合成活性和 5'-3' 外切活性 , 但是无 3'-5' 外切活性。在 95℃ 的半衰期为 40 分钟。启动 PCR
反应的能力很强，聚合速度快，在 72℃ 的聚合速度为每秒 30-100 碱基。由于没有 3'-5' 外切活性，在扩增过程中有
8.9-11x10 -5 的错配几率。
② Tth DNA 聚合酶
Tth DNA 聚合酶来自嗜热热细菌（Thermus thermophilus）HB8 ，由 Promega 公司开发成商品。 Tth DNA
聚合酶分子量为 94kDa ，在 74℃ 进行扩增，在 95℃ 的半衰期为 20 分钟。 在 Mg2+ 存在下，条件下以 DNA 为模板合成
DNA ，而在 MnCl2 存在下可以 RNA 为模板合成 cDNA 。因此可在高温下做 RT-PCR 、反转录和引物延伸（primer
extension）反应， 避免 RNA 反转录过程中形成的二级结构。
③ Vent DNA 聚合酶
Vent DNA 聚合酶是从由火山口分离的嗜热球菌 Thermococcus litoralis 中分离的第一个具有 3'-5' 外切活性的高温
DNA 聚合酶，由 New England Blabs 公司开发出商品。酶分子为 85kDa ，具有更长的半衰期，在 100℃（使用
MgSO4）时，其半衰期为 1.8 小时。
④ Pwo DNA 聚合酶
Pwo DNA 聚合酶来自 Pyrococcus woesei（BM），大小为 90kDa ，由原德国宝灵曼公司开发。在 100℃ 的半衰期大于 2 小时，出错率低。是使用较多的具有 3'-5' 外切活性的且具有高保真度的 PCR 酶。
⑤ Pfu DNA 聚合酶
Pfu DNA 聚合酶来自激烈热球菌（Pyrococcus fariosus），具有理想的扩增保真度，具有极高的热稳定性，是目前使用最广泛的具有 3'-5' 外切活性的 PCR 酶。
⑥ 商用混合酶
为了提高扩增的保真度或扩增较长的 DNA 片段，将 Taq DNA 聚合酶的强启动能力和具有 3'-5' 外切活性的高温 DNA 聚合酶的高持续活性和校正功能结合起来，可以达到很好的效果。
