生物样品分析方法的建立
生物样品分析一般指的是生物基质样品中的目标化合物的定量分析，临床检测、药物研究中的BE、PK/PD都涉及到生物样品分析。生物样品基质一般是血浆、血清、尿液、胆汁、粪便和组织脏器等。分析方法最主要的是要保证分析的准确度、精密度和重现性，生物样品分析相较于化学分析比较难的是生物样品基质存在很大的基质干扰，同时很多药物在体内的稳定性和体外有很大的不同。建立生物样品分析方法首先从体外分析开始，再加入基质去建立方法。
一．不含基质样品分析方法：
1.1质谱参数优化：
生物样品分析的药物浓度低、基质干扰大，为了达到比较高的灵敏度，一般都是用LC/MS-MS来分析。建立分析方法第一步是拿到COA之后考虑目标物的溶液的稳定性，找到合适的溶剂，兼顾稳定性和液质分析的适用性。接着建立目标物的质谱方法，Q1扫描目标物的分子离子峰，MS2扫描分子离子峰的子离子，选择高响应的离子对进行MRM参数优化，保存最优化的参数，最后修改为和液相色谱串联的方法，修改雾化气流量和离子源温度。
1.2液相参数：
配置适合浓度的样品进行LC-MS/MS分析，优化初步的液相方法，液质联用一般都是选用100mm的短柱，经验上乙腈做流动相峰形比较好，甲醇做流动相质谱响应会提高，有些情况加入一定量的甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵等也会提高响应，同时也有助于改善峰形。确定了初步的液质分析方法后，下一步要优化含有生物基质样品分析方法。
二．基质样品分析：
2.1样品前处理：
生物样品基质效应大，样品前处理时生物样品分析很重要的一步，根据第一步中化合物的响应，将药物添加到生物基质中，配制适合浓度的基质样品，这里需要注意有机试剂的含量不要超过总体积的5%，生物样品前处理方法一般包括蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取等，蛋白沉淀处理简单，但基质效应大，根据药物的性质选择合适的前处理方法。对样品进行前处理后，利用一进行LC-MS/MS分析，如果根据色谱图就能明显看到干扰峰，那需要进一步优化色谱条件，包括流动相和色谱柱都可能需要更换。
除了色谱峰的干扰，采用MRM扫描相对来说选择性已经很高了，但基质成分会抑制或增强药物的信号浓度，有的甚至会导致待测物一点信号都没有，在这种情况下，优化色谱条件几乎没有什么改善了，只能从前处理方法来下文章了，如何降低基质效应，可以参考公众号之前推送的生物样品分析方法中基质效应的考察和如何降低生物样品分析基质效应。
回收率基本也是前处理所影响的，蛋白沉淀不需要过多考虑回收率的问题，液液萃取和固相萃取需要多加关注，基质效应和回收率都是不要求达到100%，但是基质效率大的话，对高浓度和低浓度样品基质干扰的程度一般是不一样的，这样很容易导致分析批的分析结果失败，ISR也容易失败。回收率不高的话也需要多做考察是哪些因素导致了回收率低，在处理样品的时候注意避免操作的不一致影响分析结果。这样才能保证分析的准确度和精密度。
2.2实际样品的考察
药物加入到基质中后，处理液在质谱没有信号还有种可能是药物加入基质中就被代谢了，体外试验的基质中酶相对比较少了，需要通过一段时间来确定，可以参考第三部分3.3的室温放置稳定性。
还有种情况是药物一进入到体内就被代谢，这样的话前面的工作就需要从新调整，监测代谢产物可能是比较好的方案了，确定这种情况就需要检测实际样品来验证之前的检测方案，这是生物样品分析中很常见的，仿制药BE试验的样品有很多的资料可以参考，但新药或者新化学物质参考资料很少，找代谢产物以及代谢产物的结构确证有时候也会是个不小的工作量。
三．稳定性
3.1溶液中的稳定性
确定了初步的分析方法后，还需要考察稳定性，药物在溶液中的稳定性应该是在一开始就需要考察的，需要考察在储存条件下母液的稳定性，保证母液的药物浓度在分析过程中是准确的。
3.2基质样品前处理后药物的稳定性：
基质样品经过前处理后，需要考察刚处理的样品和处理后放置一段时间后药物含量是否有变化，处理后的稳定性要能保证样品处理到检测完成这个过程中，待测物是稳定的，如果稳定性达不到要求，需要从新优化条件。
3.3 基质样品室温放置的稳定性：
将刚配制的样品和室温放置一段时间的相同浓度的样品进行分析，考察样品在室温放置是否稳定，保证样品取出到处理结束这个过程中样品是稳定的，如果不稳定，那需要找到影响稳定性的因素，规避掉这些因素，在稳定的条件下去处理样品，如基质内可能会存在一些酶，有些药物会立即被酶代谢，这个时候可以考虑取样后立即将酶灭活。实在无法达到就需要将时间缩短，保证在这个时间范围内样品是稳定的。
3.4冻融稳定性：
冻融稳定性是考察样品经过一次或多次冻融后的稳定性，一般做1,2,3,4次冻融，先分析4次冻融样品是否稳定，不稳定再分析3次冻融，依次往下。
稳定性考察是为了保证在样品接收到检测过程中样品是稳定的，方法建立过程中需要考察影响样品稳定的因素，在分析过程中进行规避。
以上是生物样品分析方法建立时必须要考虑的问题，方法建立往往不是一蹴而就的事情，有很多细节需要琢磨。呈现在纸面的更多是方法确证和样品检测结果，但花多一点时间去做方法绝对是磨刀不误砍材工的，由于作者经验和水平有限，如有错漏，欢迎大家拍砖。
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