免疫多聚酶链反应
实验概要
免疫多聚酶链反应(PCR)是一种抗原检测系统，将一段已知序列的DNA片段标记到抗原抗体复合物上，再用PCR方法将这段DNA扩增，然后用常规方法检测PCR产物。由于PCR具有强大的扩增能力，因而比常规的免疫学检测法，如ELISA和放射免疫测定(RIA)的敏感性提高好几个数量级。
实验原理
免疫PCR的原理与ELISA和RIA等常规免疫学检测方法基本相同，只不过是用DNA片段代替了酶或放射性核素作为标记物。通常需要一个对抗体和DNA具有双亲和力的连接物，将DNA与抗体偶联在一起。抗体与抗原结合后，用该DNA片段特异的一对引物做PCR，分析扩增产物。特异性PCR产物的存在表明有该DNA片段标记的抗体所针对的特异性抗原存在。
将DNA标记到抗体分子上的方法有多种，一种是通过链亲和素(streptavidin)蛋白A(protein A)的融合蛋白，它具有两种独立的结合功能，链亲和素结合生物素(biotin)，蛋白A结合免疫球蛋白G的Fc片段，从而使生物素标记的DNA片段连接到IgG分子上。另一种方法是用单特异性的多价结合分子，如亲和素(avidin)或链亲和素，它们是四价分子，即一个分子可与四个生物素分子结合，因而可以将生物素标记的DNA片段与生物素标记的抗体分子结合到一起。
主要设备
免疫PCR可以在96孔塑料板(ELISA板)或微量离心管(0.5ml)中进行。
实验步骤
1. 生物素标记特异性抗体免疫球蛋白(如IgM、IgG)的Fc片段上有糖基存在，因而可用能与糖基结合的BiotinLChydrazide作生物素标记。
1) 将纯化的抗体(IgM或IgG，0.1-1mg/ml)在标记缓冲液(0.1mol/L NaAc,pH值5.5，0.1mol/L NaCl)中4℃透析过夜。
2) 吸取0.5ml至微量离心管中，加过碘酸钠溶液至终浓度10mmol/L，置冰浴上于暗处孵育30min，使抗体分子上的糖基氧化。
3) 将氧化的抗体过PBS平衡的Sephadex G25 PD10预装柱(Pharmacia)，使之与过碘酸钠分开。收集蛋白峰。
4) 向抗体管中加入biotinLChydrazide(Pierce)至终浓度5mmol/L，置混摇器上室温孵育1h。
5) 用含0.02% NaN３的PBS平衡Sephadex G25预装柱，将生物素标记的抗体分子过柱与游离的生物素分开。收集蛋白峰，保存在-20℃。
2. 生物素标记DNA片段作为将与抗体偶联的报告DNA片段，应确保在待测抗原来源的机体DNA中无同源序列，如可选用大肠杆菌的序列作为报告DNA去检测人源的标本。DNA片段大小为300-500bp，生物素标记可采用PCR方法，根据报告DNA的核苷酸序列合成一对引物，其中一个引物的5′端碱基上带有生物素标记。
1) 在0.5ml PCR管中将下列试剂混合：
试剂添加量终浓度10×PCR缓冲液10μl1×25mmol/L 4dNTP混合物8μl 0.2mmol/L
50μmol/L生物素标记的上游引物1μl 0.5μmol/L
50μmol/L下游引物1μl 0.5μmol/L
15mmol/L MgCl２1μl 15mmol/L模板DNA1μl<1μgTaqDNA聚合酶1μl5U加H２O至100μl
2) 混匀后上面覆盖液体石蜡。
3) 95℃加热5min，然后在PCR仪上按下列程序扩增：94℃ 1min；55℃ 1min；72℃ 1min；40个循环。最后72℃延伸10min。
4) 加等量酚氯仿抽提，然后加10μl 3mol/L KAc,250μl无水乙醇，置-70℃ 30min。
5) 离心沉淀DNA片段，用70%乙醇洗一次。
6) 将沉淀干燥后重溶于TE缓冲液，保存在-20℃。
3. 制备抗体亲和素DNA复合物将生物素标记的抗体与亲和素按等分子浓度混合于含有1mg/ml BSA的PBS中，室温孵育30min，再加入两倍分子浓度的生物素标记的DNA片段，继续孵育30min，最后加入10倍分子浓度的生物素，将亲和素分子上的结合部位饱和。最后过凝胶过滤柱将复合物与未结合的单体分开，加BSA达1mg/ml，分装后冻存于-20℃。
4. 免疫PCR
1) 按常规ELISA方法，用包被缓冲液稀释抗原，加到96孔塑料板或0.5ml PCR管中，4℃过夜。
2) 用PBS洗三次，然后每孔加200μl封闭液(PBS含10mg/ml BSA,1mg/ml鱼精DNA)，室温孵育3min。
3) 用TETBS(其配方：20mmol/L TrisHCl pH值7.4，0.15mol/L NaCl,01% Tween 20, 0.1mmol/L EDTA,0.02% NaN３)洗三次。
4) 将抗体亲和素DNA复合物稀释于含有1mg/ml BSA和0.1mg/ml鱼精DNA的TETBS中，每孔加50μl，室温孵育1h。
5) 用TETBS洗5次，然后将塑料板或管倒置在吸水纸上拍打以控干水分。
6) 每管中加50μl PCR反应液，含有下列成分：
试剂添加量终浓度
10×PCR缓冲液5μl1×
2.5mmol/L4dNTP混合物4μl 0.2mmol/L
50μmol/L上游引物0.5μl 0.5μmol/L
50μmol/L下游引物0.5μl 0.5μmol/L
15mmol/LMgCl２5μl 1.5mmol/LTaqDNA聚合酶0.5μl2.5U加H２O至50μl
7) 混匀后，上面覆盖液体石蜡。
8) 95℃加热5min，然后在PCR仪上按下列程序扩增35个循环：94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min。最后72℃延伸10min。
9) 每管取5μl作琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色后观察结果，如在PCR时加入了放射性核素标记，则可用X光片显影。
亦可在凝胶电泳后做southernblot，用特异性探针杂交，进一步提高其特异性和敏感性。
注意事项
本实验的关键步骤是获得适当的抗体DNA复合物。用链亲和素将生物素标记的抗体与生物素标记的DNA偶联的方法，因每个链亲和素分子可与四个生物素分子结合，因此要优化反应条件，以使得每个链亲和素分子既能结合上抗体分子，又能结合上DNA片段。
此外还可用化学方法将DNA片段与抗体分子共价偶联，即将抗体分子和5′端氨基修饰的DNA片段分别用不同的双功能偶联剂激活，然后通过自发的反应偶联到一起，比如，用NSuccinimidylSacetyl thioacetate(SATA)活化氨基修饰的DNA片段，用SulfoSuccinimidyl 4(maleimidomethyl) Cyclohexane1Carboxylate(SulfoSMCC)修饰抗体分子，然后将二者在一小管中混合，通过加入盐酸胲(Hydroxylamine hydrochloride)使二者偶联在一起。免疫PCR具有高度敏感性。因此，抗体和标记DNA的任何非特异性结合均会导致严重的本底问题。因而在加入抗体和标记DNA后必须尽可能彻底地清洗。即使有些特异性结合的抗体或标记DNA被洗掉了，亦可在最后通过增加PCR的循环次数得到弥补。此外，应用有效的封闭剂对防止非特异性结合也是非常重要的。可用脱脂奶粉和牛血清白蛋白做蛋白封闭剂，用鱼精DNA做核酸封闭剂。防止本底信号的另一个重要因素是控制污染，这也是所有敏感的检测系统存在的问题。即使每一步试验都做得非常认真，重复使用同样的引物和标记DNA均会产生假阳性信号。免疫PCR的一个主要优点是标记DNA序列完全是人为选定。因此标记DNA及其引物可经常变换，以避免由于污染造成的假阳性信号。
免疫PCR可以检测到常规免疫学方法无法检测的样品。因此，应用免疫PCR可在微观水平(单细胞)检测到抗原，定量PCR产物可以估计某一标本中的抗原数量，在临床诊断中可在疾病早期抗原量很低时检测到微量的抗原。
